汉滩病毒M基因G2片段与S基因0.7Kb片段嵌合基因的表达及基因免疫的研究

发布时间：2020-09-24 13:37

　　肾综合征出血热（HFRS）是一种由汉坦病毒属病毒引起，临床上主要表现为发热、出血和肾功能损害的急性病毒性传染病。该病是我国死亡人数最多的急性病毒性传染病之一，年发病人数为5-10万人，临床病情严重，病死率较高。目前尚缺乏特异有效的预防和治疗方法。汉坦病毒属布尼亚病毒科，是一种有囊膜的单股负链RNA病毒，基因组分为大（L）、中（M）、小（S）3个节段，分别编码病毒的RNA依赖的RNA 聚合酶、囊膜糖蛋白（G_1和G_2）以及核蛋白（NP）。研究表明，汉坦病毒的M基因编码的囊膜糖蛋白（GP）可刺激机体产生中和抗体，而对感染动物和人体起到保护作用，且GP的中和抗原位点主要位于G_2上。但 GP免疫原性较弱，刺激产生的抗体出现晚，滴度不高。本室前期研究结果表明，汉坦病毒S基因编码的NP抗原位点主要集第四军医大学博士学位论文一中在8基因编码区5’端约0．7＊b片段的编码蛋白上。另外，NP八泊病》：Z 结构蛋白中免疫原性最强，其刺激机体产生的特异性抗体出现早、涧度高、维持时间长。国内外研究结果均证实NP不仅具有很强的兔疫原性，而且它也具有诱导免疫保护，包括诱导机休细胞免疫应答的作用。因此，汉坦病毒GP和NP在诱导机体免疫应答中可能均起重要作用，如何发挥不同结构蛋白在诱导机体免疫应答中的优势互补作用，是汉坦病毒基因工程疫菌研究中亟待解决的问题。本实验将编码HTNV GZ的M基因片段与编码NP氨基端aal274的 S基因片段进行了融合表达，以期达到不同结构蛋白在诱导机体免疫应答中的优势互补。首先，我们构建了嵌合片段的原核表达载体pGEX4Tl －GZSO．7与pGEX＊T1．7G2，诱导表达了相应的融合蛋白GST－G。NO．7、 GST－NO．7G2，并采用 SDS－PAGE、WestCS－blot及ELISA方法对表达产物进行鉴定。SDS．PAGE未能观察到融合蛋白的表达带：Western－hi血结果表明，嵌合基因在原核表达系统中表达了分子大小正确的融合蛋白，且该融合蛋白与抗HINV NP特异性mAb有一定的结合活性：ELISA结果表明，嵌合基因表达的融合蛋白不仅与抗HThV NP特异性mAb有较高的结合活性，与抗HINV GP特异性mAb也有较弱的结合活性，证明该融合蛋白保持了亲本蛋白各自的活性。在原核表达嵌合基因的基础上，我们又构建了嵌合基因及其亲本基因的真核表达载体pCDNA3．IGZSO．7、pCDNA3．ISO．7G2、pCDNA3．IG2以及 pCDNA3．1S．7，并进一步研究了各重组真核表达载体在哺乳动物细胞中的表达以及基因免疫对诱导小鼠产生体液及细胞免疫应答的能力。同时我们还比较了不同佐剂对基因免疫效果的影响。用脂质体法转染COS－7细胞，用RTPCR、间接免疫荧光法及免疫共沉淀检测表达结果，结果表明各重组质粒在哺乳动物细胞中可以表达相应的目的蛋白，且嵌合基因表达吕第四军医大学博士学位论文一的的确为融合蛋白。用重组真核淡达8划木见疫BALB儿小鼠，并川ELSA 法检测免疫鼠血清特异性抗体，用细胞微显培养中和试验检测鼠免疫血消中的中和抗体，用淋巴细胞增殖试验检测免疫鼠的细胞免疫应答效果。 ELISA检测结果表明，嵌合基因可同时诱导产生抗HTNV NP及GZ糖蛋白的特异性抗体，且pCDNA3．IGZSO．7组的抗NP特异性抗体的效价与 pCDNA3．ISO．7组相当，其抗GP特异性的抗体效价比pCDNA3．IGZ组要高：而pCDNA3．ISO．7G2组与pCDNA3．ISO．7组及pCDNA3．IGZ组相比，其抗体效价明显低于这两组；各组用佐剂免疫的小鼠，加空载体佐剂组刺激机体产生抗体的水平明显高于IL－2组与不加佐剂组。微量细胞培养中和试验检测结果表明，各免疫组小鼠均产生了不同滴度的中和抗体，但中和抗体效价较低。淋巴细胞增殖试验表明，嵌合基因免疫小鼠的脾细胞对 NP及GP的增殖指数均明显高于空载体对照组；pCDNA3．IGZSO．7组增殖指数比eDNA3．IS0．7组高，与pcDNA3．IGZ组相近：但pcDNA3．l －SO．7G2组未检测到其淋巴细胞有明显的增殖。淋巴细胞增殖试验结果还表明各组用佐剂免疫的小鼠，加空载体佐剂组刺激机体产生特异性细胞免疫的水平明显高于IL－2组与不加佐剂组。以上实验结果表明，HWIV M基
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2001
【中图分类】：R373.32

【引证文献】