Apo（a）对小鼠骨髓源性内皮祖细胞血管生成能力的影响及其机制研究

发布时间：2020-10-11 00:57

　　 周围血管疾病一直严重危害着人类健康，目前尚无非常有效的治疗方法。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的发现开辟了一条新的治疗途径。EPCs是成熟血管内皮细胞的前体细胞，既可不断增殖，又能定向分化为成熟的内皮细胞，在血管生成中具有多种功能。载脂蛋白(a)[(apolipoprotein(a)，apo(a)]是脂蛋白(a)[lipoprotein(a)，Lp(a)]重要组成成分，也是周围血管疾病独立危险因子。有文献报道了Lp(a)对EPCs生物学功能的影响，但有关Lp(a)对内皮细胞及EPCs的增殖、分化作用，仍存在两种截然对立的实验证据。血清Lp(a)水平不受环境、饮食和药物的影响，而apo(a)的合成情况可影响着Lp(a)血清浓度，并且apo(a)还可独立于apoB-100或Lp(a)而单独影响血管病理生理功能。但apo(a)影响EPCs血管生成及其机制尚不清楚。 本研究从小鼠骨髓分离培养EPCs，观察apo(a)对EPCs体内外血管生成能力的影响，并探讨了其机制。主要研究结果及方法如下： 第一部分Apo(a)对小鼠骨髓源性EPCs血管生成能力的影响 目的：研究apo(a)对小鼠骨髓源性EPCs迁移、粘附、归巢及血管生成能力的影响。 方法：从小鼠骨髓分离、培养、鉴定EPCs，观察apo(a)对EPCs粘附、迁移及matrigel胶上血管腔样结构的影响；复制小鼠下肢缺血模型，3×10~5EPCs移植下肢缺血实验小鼠，于移植后第3、7、14天取小鼠腓肠肌，检测缺血组织EPCs归巢数量及毛细血管密度；RT-PCR、western blot检测P/E selectin、PGSL-1、CXCR4、VEGF表达。 结果：小鼠骨髓源性EPCs可吞噬Dil-AcLDL并结合UEA-1，原代EPCs细胞表面标志CD133+/VEGFR-2+、CD34+/VEGFR-2+、vWF分别为72.2%、71.26%和1.0%。Apo(a)呈剂量依赖性抑制EPCs粘附能力：加入0.2μg/ml apo(a),与对照组相比，粘附率减少94.2%(P0.01)，加入15μg/ml apo(a), EPCs几乎完全凋亡，体外迁移实验也取得了相似结果。Mtrigel胶上，10μg/ml apo(a)时，野生型鼠EPCs及转基因鼠EPCs血管腔样结构被破坏92.1%(P0.01)。RT-PCR及western blot检测到缺血组织血管内皮表达P/E selectin，VEGF在缺血组织表达升高，而PGSL-1、CXCR4在apo(a)处理的EPCs表达降低；动物实验中，对照鼠缺血组织血管周围可见EPCs募集，而转apo(a)基因鼠不但EPCs归巢数量显著减少(P0.05)，毛细血管生成数量也显著减少(P0.05)。 结论：apo(a)可抑制EPCs粘附、迁移、归巢及血管生成能力。 第二部分Apo(a)影响EPCs血管生成能力的机制研究 目的：探讨apo(a)抑制EPCs血管生成的机制。 方法：收集培养的EPCs，提取总RNA, RT-PCR检测Notch受体、配基及LOX-1表达；分析apo(a)影响它们表达的最大时效、量效关系；免疫共沉淀检测apo(a)对Notch受体、配基结合的影响，RT-PCR检测下游基因表达。 结果：小鼠骨髓源性EPCs只检测到Notch2受体和JAG-1、JAG-2配基表达，而且在10μg/ml apo(a)处理24小时表达最高；apo(a)促进Notch2与JAG-1配基结合，RBPJ、HES、HEY的mRNA表达量分别增加30%、27%及22%(P0.05)，CXCR4、PGSL-1蛋白表达量分别降低72%与80%(P0.05)，但VEGF表达无显著变化。封闭LOX-1受体后，免疫共沉淀检测不到Notch2受体与JAG-1配基结合，CXCR4、PGSL-1、VEGF表达与LOX-1封闭前相比，无显著差异。 结论：apo(a)促进Notch受体配基结合,上调RBPJ、HES、HEY表达，降低CXCR4、PGSL-1表达，抑制EPCs的粘附、迁移、归巢及血管生成能力；LOX-1参与了apo(a)对EPCs血管生成的影响。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R363
【部分图文】：

实验结果1.小鼠骨髓内皮祖细胞分离与诱导培养收集冲洗后的全骨髓细胞，经 1800rpm、20min 离心后，小心吸取经密度梯度离心分离的中间云雾状单个核细胞，于 0.1%明胶包被的培养瓶中 5ml 含 VEGF 的 M199 诱导培养，半小时后细胞即开始贴壁，24 小时后观察，少数贴壁细胞开始变形，3 天左右即长出长梭形的细胞，随后呈漩涡状生长逐渐融合培养瓶，随着时间延长，细胞增殖减慢，6-7 天左右细胞增殖停止，此后进行传代培养，但这种细胞传代能力差，传 2 代左右，细胞形态开始变形，出现枫叶状或竹叶状形态，细胞表面标志也发生改变，为早期 EPCs(early EPCs) （图 1-1，图 1-2）；BA

图 1-2 传代培养的早期 EPCsA：传代的早期 EPCs（P1 代）(20×)； B：细胞形状变得不规则，呈枫叶或竹叶状（P3代）(40×)。分离后的单个核细胞于贴壁培养 24 小时后，吸取悬浮的未贴壁细胞，种植于另一明胶过夜包被的培养瓶，进行二次贴壁培养。二次贴壁的细胞于贴壁后呈短梭形或椭圆形，6-7 天细胞停止增殖，此时不要收获细胞，继续延长培养，大约 2 周左右即可出现集落，胞体较大，典型细胞集落形成，血岛样，周围细胞呈放射状生长，这些呈集落样生长的细胞即是小鼠骨髓内皮祖细胞，随着培养时间延长，细胞集落逐渐增大，细胞增殖加快，3 周左右即可呈铺路石样融合整个培养瓶，此时按 1：2 传代培养（图 1-3）。这种铺路石样生长细胞，性

23图 1-3 晚期 EPCs 原代培养 （第二次贴壁）（20×）A：第 1 天，可见贴壁细胞；B：贴壁后第 3 天，第一次换液，细胞开始增殖，呈集落趋势生长；C：第 15 天左右可见明显的细胞集落；D：放大的单个细胞集落，集落中间细胞集聚，周围细胞放射状向四周生长（40×）；E：细胞集落不断增殖扩大，逐渐向四周融合；F：第 20 天左右，众多集落增殖融合整个培养瓶。
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 骆志清;王毅;罗志刚;;Notch信号通路在诱导免疫耐受作用中的研究进展[J];临床和实验医学杂志;2008年01期

2 蔡文杰;王铭洁;朱依纯;;下肢缺血模型中微循环功能研究方法的建立[J];中国药理学通报;2010年05期

本文编号：2835804