福氏志贺氏菌2a ArgT蛋白的表达调控及功能研究

发布时间：2020-10-11 03:42

　　 福氏志贺氏菌是一类具有高度传染性的革兰氏阴性杆菌,能够侵入人的肠上皮细胞而引起细菌性痢疾。目前治疗痢疾的主要方式是抗生素,但高达95%的临床分离株对多种抗生素产生了耐药性;最佳手段是疫苗,但对其致病机理和宿主的免疫保护机制还不很清楚。而细菌毒力的表达并不是简简单单一个或几个蛋白的作用,而是毒力大质粒和染色体上众多基因产物相互作用的一个复杂网络,其中涉及到的蛋白必定会远超出我们已知的这些毒力相关因子。因此对志贺氏菌的基础研究就显得尤为重要,发现新的毒力相关蛋白,并明确它们的表达调控就成为我们工作的重点。 本实验室在志贺菌福氏2a 2457T野生株和驱除毒力大质粒的突变株进行30℃和37℃两种温度下比较蛋白质组研究时发现,某蛋白点的变化比较奇怪,于是本论文中首先采用窄梯度胶条对志贺菌福氏2a 2457T蛋白进行双向电泳分离,发现这个位置实际上对应两个蛋白点,质谱鉴定的结果是30℃表达上调的蛋白是ArgT,37℃表达上调的蛋白是PhoN2。其中PhoN2是毒力大质粒编码的一个毒力蛋白;而ArgT蛋白基因组注释为赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸转运蛋白,目前对于ArgT这种温度依赖的表达调控以及在志贺菌福氏2a 2457T中的功能还没有报道。结合福氏志贺氏菌在37℃时发挥完整的细胞侵袭力,而在30℃时却不能侵袭上皮细胞的现象,推测这个蛋白可能与志贺菌福氏2a 2457T的毒力有一定的相关性。 本文首先对ArgT温度依赖的差异表达调控机理进行了研究。通过半定量RT-PCR的方法确定ArgT的表达调控不在RNA水平;通过过表达载体强制表达ArgT的实验确定ArgT的表达调控发生在蛋白水平,是37℃时在翻译后水平发生降解,而且这种降解不依赖于新蛋白的合成,是发生在周质的间隙内。另外,通过缺失突变体构建和体内实验确定周间质蛋白酶HtrA就是37℃时降解ArgT的关键蛋白酶;通过HtrA失活突变体构建和体外生化实验证实ArgT的降解是由HtrA直接单独负责的,不需要其它蛋白的参与。蛋白酶HtrA30℃时不降解ArgT是因为低于35℃时HtrA基本没有蛋白酶活性。通过体外降解和质谱鉴定相结合的方法确定了HtrA降解ArgT时的一个切割位点,位于160位Val和161位Ala之间,和文献报道的HtrA切割底物时其切割位点前一般是Val或Ile残基是相符的。通过点突变发现ArgT 225位的Try突变为Asp (大肠杆菌ArgT 225位对应的氨基酸)后降解现象即不发生,推测225位时HtrA降解ArgT时的一个识别位点,因为文献报道HtrA在降解底物时其PDZ结构域识别疏水的或者是芳香族的氨基酸残基,而Try正是一个芳香族氨基酸。 接下来本文对ArgT蛋白对志贺菌福氏2a 2457T毒力的影响进行了评价。我们知道,病原菌在从共同祖先进化过程中涉及到毒力基因的获得和抗毒力基因的失活,抗毒力基因在病原菌中不是必需的,强制表达它们还会使病原菌的毒力下降。2457T的argT基因在不发挥毒力的30℃时是正常表达的,而在发挥毒力的37℃时其表达产物被周间质蛋白酶HtrA降解。另外,志贺菌福氏2a 2457T的ArgT和大肠杆菌DH5α的ArgT只有三个氨基酸的差别,在2457T中ArgT被降解,而在DH5α中ArgT是不被降解的。已知志贺菌福氏2a 2457T在30℃时没有侵染毒力,而37℃时毒力表现正常;另外大肠杆菌是福氏志贺氏菌的非病原祖先,所有这些现象表明ArgT似乎和福氏志贺氏菌的毒力有一定联系,很可能是一个抗毒力基因。由此本文构建了志贺菌福氏2a 2457T的argT缺失的突变株和ArgT通过低拷贝质粒过表达且不降解的突变株,通过突变株与野生株竞争性侵袭HeLa细胞的毒力评价模型发现,argT缺失株的毒力与野生株基本一致,而ArgT过表达株的毒力明显比野生株减弱。另外,通过突变株与野生株竞争性侵袭小鼠肺部细胞的毒力评价模型再次证实,ArgT过表达株的毒力明显比野生株减弱。这些实验表明argT应该是福氏志贺氏菌中一个新的抗毒力基因,而且代表了一种新的模式,是通过蛋白降解而不是基因缺失或失活。 最后对ArgT的其它生物学功能进行了探讨。蛋白质在细胞中并不是独立地完成被赋予的功能,它们通常与其他蛋白质相互作用形成大的复合体,在特定的时间和空间内完成特定的功能。因此本文以GST-ArgT为诱饵蛋白,通过GST pull-down拽取2457T 37℃条件下对数生长晚期的全菌蛋白中和ArgT存在相互作用蛋白,然后进行双向电泳分离及质谱鉴定,鉴定到两个捕获蛋白Cyp和OmpR。其中OmpR是双组分(OmpR/ EnvZ)渗透压感知调节系统的一部分,是一个毒力相关因子,可以调节vir基因和OmpF/C的表达。另外,基因的缺失和过表达在蛋白水平无疑也会影响与其功能相关的一些蛋白的表达。所以本文还对argT缺失和过表达的突变体的全菌蛋白与野生株的全菌蛋白进行了的比较蛋白质组研究。在全菌蛋白图谱中共鉴定到了10个表达差异的蛋白点,代表9种蛋白。其中在argT缺失株中表达上调的有2个,表达下调的有3个;在ArgT过表达株中表达上调的有3个,表达下调的有2个。 综上所述,志贺菌福氏2a 2457T的ArgT蛋白在30℃和37℃两种温度下差异表达的调控机理是,在表现毒力的37℃时翻译后的ArgT蛋白立即被周间质蛋白酶HtrA降解;而不表现毒力的30℃时因为HtrA没有蛋白酶活性,所以ArgT不被降解。在非病原宿主大肠杆菌中ArgT是表达的且行使正常的氨基酸转运功能;在病原宿主福氏志贺氏菌中ArgT发生了三个点突变,从而在37℃时被降解。而且经细胞侵袭和小鼠肺部侵袭两种毒力评价模型证实,在志贺菌福氏2a 2457T中强制表达ArgT会使其侵袭毒力明显减弱,推测argT应该是一个抗毒力基因。另外,蛋白间相互作用和ArgT不同表达水平的比较蛋白质组研究为综合分析ArgT的生物学功能提供了参考。
【学位单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2008
【中图分类】：R378
【部分图文】：

. 志贺菌福氏 2a 2457T 在 30℃（图 A）和 37℃（图 B）全菌蛋白双聚焦使用的 IPG 胶条梯度为 pH4.5-5.5；SDS-PAGE 电泳的凝胶浓度和结果查询窄梯度双向电泳图谱我们发现，表达模式奇怪的蛋白白点，30℃左边的蛋白表达上调，37℃右边的蛋白点分别进行胶内酶切、质谱鉴定。对质谱数据首先使的福式志贺氏菌 2a 2457T 数据库进行肽质量指纹e 网站（http://www.matrixscience.com）提供的 NCBI30℃表达上调的左边蛋白是 ArgT，37℃表达上调的ArgT↘ ↙PhoN2B↙

图 1-4. 蛋白的质谱数据的 Mascot 检索结果A：30℃表达上调的左边蛋白 ArgT Mascot 检索结果；B：37℃表达上调的右边蛋白 PhoN2 Mascot 检索结果。讨论采用 pH4.5-pH5.5 的窄梯度胶条对志贺菌福氏 2a 2457T 30℃和 3进行双向电泳分析，发现确实在胶图上很好地分离了等电点在 4.，而且在朱力研究中那个表达模式奇怪的蛋白点也分离成为两个独鉴定的结果是：30℃表达上调的左边蛋白是 ArgT，37℃表达上调N2。PhoN2 是志贺菌福氏 2a 2457T的毒力大质粒编码的一个毒力蛋白，腺苷双磷酸酶活性。近来研究表明，PhoN2 是IcsA蛋白在菌体表面志贺氏菌在宿主细胞间扩散所必需的，但PhoN2 与IcsA之间可能并作用[59]。既然PhoN2 是志贺菌福氏 2a 2457T的一个毒力蛋白，那

图 2-1. pETKan 重组载体的构建。打靶 DNA 的构建福氏 2a 2457T 野生株为模版，采用全菌 PCR 的方法扩增同源臂。同源臂 PCR 产物连接到 pMD18-T 载体，送交公司测序。测序正确后，分别使用上下游同源臂两端引物上设计的相步连接到 pETkan 载体上。证正确后，用 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切。经胶回收试剂盒源臂为 500~600bp 的线性打靶 DNA。段为模板，PCR 扩增出打靶基因，再次以胶回收试剂盒获得浓度高达 300 ng/μl 线性打靶 DNA 片段。盒构建的流程如下图所示：
【引证文献】

相关博士学位论文 前2条

1 史曼;类风湿性关节炎关节滑膜细胞基因表达谱分析[D];第四军医大学;2010年

2 郑子瑞;福氏志贺氏菌T3SS效应分子IpaH4.5干扰宿主先天性免疫的研究[D];吉林大学;2012年

本文编号：2836006