人红细胞嘧啶5’-核苷酸酶蛋白的分析鉴定、微量测序及其cDNA文库的构建

发布时间：2020-10-11 03:55

　　 人红细胞嘧啶5'-核苷酸酶（EC3.1.3.5.P5'N）缺陷可导致遗传性非球形 细胞溶血性贫血。其发病率占所有遗传性红细胞酶病中第三位。至今己报道35个 家系，约70多例。目前已发现 P5'N有两种同工酶：和 P5'N-Ⅱ，仅P5'N-I 缺乏可引起溶血性贫血，而P5'N-Ⅱ的活力正常，其发病机制仍未完全阐明。为 进一步研究其生化特性，获得P5'N的cDNA序列，进而得出该酶的蛋白质一级结 构，以进一步探讨其发病机制。我们在纯化P5'N-Ⅰ的基础上，对该酶蛋白进行 了分析鉴定和微量测序，对一例遗传性P5'N-I缺陷症家系进行追踪调查，并构 建了相应 cDNA文库。 方法： 一、建特异性亲和层析柱，纯化人红细胞P5'N-Ⅰ。 二、对纯化的P5'N-Ⅰ分析鉴定、微量测序及氨基酸组成分析 1、对纯化的 P5'N-IESI质谱分析。 2、通过将纯化的P5'N-I液直接送检；转至PVDF膜的 P5'N-Ⅰ液；经 胰蛋白酶水解，HPLC收集水解片段进行微量测序。 3、将所测序列进行生物信息学分析，寻找同源性片段。 4、将纯化的 P5'N-Ⅰ液经酸水解后，进行氨基酸组成分析。 三、对一例遗传性 P5'N-I缺陷症家系进行酶活力、酶蛋白定量及外周血红 细胞形态调查，并将其白细胞冻存，保存基因资源。 四、用经G-CSF、GM-CSF动员后分离的正常人外周血CD34＋细胞作为mRNA来 源，构建PCR介导的cDNA文库。 结果： 一、交联率40％，达到了亲和层析纯化蛋白所要求的标准。纯化蛋白SDS-PAGE 示单一条带。 二、对纯化的 P5'N-I分析鉴定、微量测序及氨基酸组成分析 1、对P5'N-I的分子量质谱分析为26952.5，同时发现存在另外两种蛋 白片段，分子量分别为55476及110938。两者分别为酶分子量的二倍 及四倍。 2、对该酶蛋白微量测序表明，其蛋白质分子中含有Ile（异亮)-Glu（谷） 且 第二军医大学长海医院血液科 博士毕业论文一中文搁要 一Gly（甘）一Pro（脯）一Thr（苏）一lie（异亮）一Arg（精）一GIN（谷 恍）一lie（异亮）一Gin（谷）序歹。 3、经blast进行相似性搜索，未发现同源性片段。 4、氨基酸组成分析示：该酶蛋白至少由18种氨基酸，约243个氨基酸 残基组成。 三、家系调查结果表明：发现一例杂合子，其酶活力下降至正常值50％，酶蛋 白定量亦下降至正常值50％以下。 四、cDNA文库的容量为2．8x10’pfu八g，插入片段全长性占77．5儿 平均长 度为1235hP。 结论： l、正常人红细胞 PS’N－I生理状态下，可能为一种变构酶，以同源四聚体 的方式发挥作用。 2、所狈部分氨基酸序列（lie－Gin－Gly－Pro－Thr－lie－Ars－GIN－11e－Gin），在 数据库中未发现同源性片段，该序列可作为筛选目的基因的探针。所测氨 基酸组成为确定其蛋白一级结构提供了重要依据。 3、除测定PS’N－I活力外，测定陀’N－I酶蛋白含量可成为一种检测杂合 子的潜在方法。 4、经对构建的cDNA文库进行检测，证明己达到构建完整cDNA文库对库容量。 完整性及全长性的要求，可用于下一步目的基因的筛选。
【学位单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2001
【中图分类】：R556.6;R341
【文章目录】：
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前 言
第一部分 人红细胞嘧淀5'-核苷酸酶I的纯化
    材料与方法
    结 果
    讨 论
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第二部分 人红细胞P5'N-I酶蛋白质分析、鉴定及微量测序
    材料与方法
    结 果
    讨 论
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第三部分 遗传性P5'N-I缺陷症家系调查
    材料与方法
    结 果
    讨 论
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第四部分 正常人外周血CD34～+细胞cDNA文库的构建
    材料与方法
    结 果
    讨 论
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小 结
致 谢
综述一 蛋白质组在医学应用中的研究进展
综述二 蛋白质组研究技术及其进展
英文索引
附 录

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 李建民,王义权,周开亚,王婉瑜;眼镜蛇毒腺cDNA文库的构建[J];蛇志;1999年03期

本文编号：2836022

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