胚泡着床三维模型的建立及子宫内膜容受性影响因素的研究

发布时间：2020-10-11 09:19

　　 胚胎着床是成功妊娠的第一步，受到激素、细胞因子、蛋白、酶等多种信息物质的调节，详细机理尚不清楚。由于着床的机理不清，阻碍了对不孕这种与着床密切相关疾病的深入了解，阻碍了助孕技术水平的提高，同时也阻碍了抗着床干扰生育方法的进一步开发。着床涉及胚胎和母体子宫双方的同步发展和变化，是一个复杂而精细的过程，直接在体研究极其困难，因此，体外模型的建立成为研究此过程的重要工具。目前国内外应用子宫组织、子宫内膜细胞及细胞外基质等已建立了许多着床模型，其中应用最多的是胚泡与单层子宫内膜上皮细胞的共培养。但这些模型绝大多数只能实现胚泡的粘附和扩展生长，而无胚泡植入子宫内膜的行为。即都不能完全模拟体内着床时胚泡与子宫内膜的关系。研究表明子宫内膜上皮细胞的极性、细胞间连接以及与基质细胞、细胞间基质的关系对于维持子宫内膜的功能非常重要，因此植入过程的研究中，除包含基底膜上有良好细胞间连接的极性上皮细胞外，同时包含细胞间基质和基质细胞也很重要。鉴于这些特点，建立含有子宫内膜上皮和基质细胞的体外培养三维模型，系统观察子宫内膜细胞的形态学、细胞骨架的改变，并进一步利用此体外模型观察雌激素、胚胎以及细胞因子等对子宫内膜容受性的调节作用，对阐明子宫内膜容受性建立的分子机制，并通过干扰容受性来干扰着床从而实现人类生育调节具有重要意义。体外模型的建立能够为研究胚胎着床提供更合理、更科学和更便捷的途经。 第一部分 子宫内膜体外三维模型的建立 一、 子宫内膜上皮细胞和基质细胞共培养三维模型 目的 用双室培养系统、Matrigel的特性，建立子宫内膜上皮/基质细胞的共培养三维模型，并进一步观察其形态学特征并与在体子宫内膜相比较，探索建立理想的体外三维模型。 材料和方法 取孕4天小鼠子宫内膜，用trypsin/pancreatin消化法制备子宫内膜上皮细胞 WP=6 和基质细胞，利用双室培养系统建立含有上皮细胞和基质细胞的三维模型。用光镜、电镜观察其形态学特征，并与正常子宫内膜比较；用细胞免疫组化方法鉴定细胞的来源和纯度。 结果 用酶消化法分离的上皮细胞和基质细胞，其纯度占90％以上。扫描电镜（SEM）观察显示，对照组孕第4天的小鼠子宫蜕膜上皮细胞有突起，表面具有微绒毛及发育中的胞饮突。体外培养的子宫内膜上皮细胞生长融合成片，同样可见容受性标志－发育中胞饮突的形成，上覆微绒毛，只是体外培养的上皮细胞胞饮突变异较大。透射电镜（TEM）结果显示，培养的上皮细胞具有极性，表面覆有微绒毛，较在位子宫内膜细胞表面的微绒毛少。同时培养的子宫内膜上皮也具有细胞间紧密连接和糖原沉积，与在体的子宫内膜相似。 小结 建立的三维模型既含有上皮细胞，又包含基质细胞及细胞外基质。其生物学特征与在体的子宫内膜基本相似，是一种较理想的体外模型。 二、 子宫内膜体外重建 目的 用组织工程方法，利用新型的多孔聚合物支架材料胶原—聚乳酸羟基乙酸共聚物杂交聚合网（Collagen-PLGA polymer mesh）作为三维支架，将子宫内膜上皮细胞和基质细胞作为种子细胞，探索建立人工子宫内膜的可行性。 材料和方法 将分离纯化的上皮细胞和基质细胞依次种植于生物可降解胶原—聚乳酸羟基乙酸共聚物杂交聚合网上下两面，光镜及扫描电镜观察细胞的生长状况。 结果 子宫内膜细胞可进入聚合网内部并粘附生长，24h后细胞粘附。扫描电镜显示在细胞培养第5天，细胞大量铺展生长，有些区域，可见融合生长。培养第14天后，扫描电镜见细胞融合成片，原胶原大部分已被子宫内膜细胞分泌的细胞外基质代替，形成三维结构。 WP=7 小结 本实验首次应用生物可降解的杂交聚合网作为支架在体外重建了子宫内膜，提示用组织工程方法建立人工子宫内膜的可行性。 第二部分 子宫内膜容受性影响因素的研究 一、 胚胎与三维模型共培养及对子宫内膜容受性的调节 目的 研究表明胚胎因素在诱导子宫容受性中具有重要作用，其具体机制还不清楚。本研究目的是将胚泡与建立的体外三维模型共培养，研究胚胎加入后，子宫内膜细胞的形态学变化、胚胎与子宫内膜相互作用的关系及对容受性标志分子整合素β3的影响，探索胚胎因素对子宫容受性形成的调节作用。 材料和方法 给小鼠超排卵刺激后交配，将妊娠第4天的小鼠囊胚培养在已建立的体外子宫内膜三维模型上，电镜观察胚胎植入时囊胚与子宫内膜上皮细胞的超微结构。并用RT－PCR法测定子宫内膜整合素β3基因水平的表达，Immunoblot法做整合素β3蛋白半定量测定。 结果 在三维模型中小鼠囊胚能正常脱透明带、粘附和扩展，小鼠囊胚24h、48h的脱带率（31.3％、72.5％）、粘附率（16.7％、58.3％）与对照组单层子宫内膜上皮（脱带率：27.7％、70.8％，粘附率：15.3％、52.8％）相比差异无统计学意义（P0.05）；体外模型中胚胎的48h扩展率16.7％与对照组40.3％相比差异具显著统计学意义（P0.05）。扫描电镜显示体外培养的子宫内膜可形成胞饮突，胚胎粘附于胞饮突上，胚胎表面覆有微绒毛。透射电镜显示培养的子宫内膜上皮细胞具
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R321
【部分图文】：

光镜观察消化出的上皮细胞呈团块状结构，其中混杂有少量的基质细胞。基质细胞呈单个细胞。见图1-1-1,1-1-2。子宫内膜上皮细胞及基质细胞分离后用 cytokeratin-18 和 desmin作为细胞表面标志来鉴定子宫内膜细胞的纯度。免疫细胞化学结果显示，上皮细胞呈 Cytokeratin 18 阳性表达，Desmin 阴性。基质细胞呈 Desmin 阳性表达，Cytokeratin 18 阴性。结果显示用此方法分离的上皮细胞及基质细胞纯度达 90％。见图 1-1-3, 1-1-4。

-2分离的子宫内膜基质细胞的形态，成单个细胞

-3子宫内膜上皮细胞cytokeratin-18免疫组化染色,
【引证文献】

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本文编号：2836396