人乳头瘤病毒16型E6E7基因的克

发布时间：2020-10-11 22:36

　　 人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是重要的性传播因子，可引起人皮肤粘膜的增生性疾病及恶性肿瘤。根据HPV与良恶性病变的关系分为低危组和高危组。HPV16是高危组最重要的基因型，与宫颈癌等泌尿生殖系恶性肿瘤的发生密切相关，除此之外还与口腔癌、肺癌、食管癌的发生具有一定的关系。我组多年攻关研究及国外报道均表明：HPV16E6及E7为病毒的主要转化基因，E6及E7的表达为癌细胞恶性表型维持所必须。流行病调查资料显示：人群感染HPV16后，可产生抗HPV16E6及E7特异免疫。因而，研制防治HPV16相关疾病的疫苗，E6和E7是理想的靶抗原。 由于E6及E7为病毒转化基因，利用E6及E7基因直接作为疫苗具有潜在的致癌性，因此去除E6及E7的转化活性，保留其抗原性是利用E6及E7研制疫苗的前提。文献报道表明E7第24位氨基酸的突变可废除E7的转化活性。为了涵盖较多的抗原表位，本研究拟利用中国宫颈癌标本中E6及E7基因作为疫苗研究的靶基因。定点突变E7的第24位氨基酸，敲除E7的转化活性，然后对E6的终止密码区进行突变修饰，构建E6E7融合基因fmE6E7(fused and mutated E6E7gene，fmE6E7)，在证实fmE6E7的转化活性敲除之后，用于DNA疫苗的构建及研究。 根据T淋巴细胞活化的双信号学说和MHC(major histocomplex)I类分子呈递抗原的规律，为了有效地活化T细胞，本研究构建淋巴细胞活化所必需的共刺激分子B7-1的真核表达质粒pcDNA3.1-B7-1，采用裸DNA肌肉接种的免疫方式，使E6E7在机体组织细胞内翻译成蛋白进入MHCI类分子抗原呈递途径，同时辅以共激活分子B7-1基因共同免疫，以期有效地活化机体的免疫反应，特别是CTL(cytotoxic T lymphocyte，CTL)活性。获得以下结果： 1．首先对宫颈癌标本中HPV的感染型别进行检测，14例宫颈癌活检标本中，
【学位单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2002
【中图分类】：Q78;R392
【部分图文】：

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泄??鸵娇迫搜Т哟∫窖г翰?:论文第二部分实验结果定向克隆入pVR1012载体内，经Xbal、Bam川双酶切，电泳可见重组载体酶切释放出约776bp的片段(如图2一2)，与E6E7片段长度一致，该重组质粒命名为pVR1012一mfE6E7。】2345776bP图2一ZpVRlolZ·mfE6E7质粒的酶切鉴定F192一2IdentifieationofthereeombinantPlasmidsPVR1012·mfE6E7入DNA/Hindlllmarker:2.PBR322DNA/BstNImarker:3.PVR1012一mfE6E7digestedwithbyXbalandBamHI:4.PVR1012一mfE6E7:5.PVR1012..1.2.pVR1012一mfE6E7重组质粒体外在Cos一7细胞中的表达J指质体法将pVR1012一mfE6E7转染Cos一7细胞，48小时后收获细胞，以C3细胞为阳性对照，pvR1012空载转染组为阴性对照。间接免疫荧光染色结果如图2一3所示:C3细胞及转染pvRI012一mfE6E7细胞的细胞核及核周围呈黄绿色阳性信号，而阴性对照组为阴性，表明pvR1012一mfE6E7可在Cos一7细胞中表达。图2一3免疫荧光组织化学法检测pvR1012一mfE6E7重组质粒体外在COs一细胞中的表达F192一3ImmunofiuerseeneenaalysistheexPressionofPVR1012一mfE6E7

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本文编号：2837218