肝炎病毒（HBV、HCV）基因诊断芯片的研制和新型肝炎病毒SENV的实验研究
发布时间：2020-10-12 00:39
HBV和HCV是临床上最常见、危害最大的两种肝炎病毒,其长期持续的慢性感染与肝硬化、肝癌的发生发展密切相关。随着人们对肝炎病毒认识的不断深入,尤其是肝炎病毒基因组学研究的进展,使临床上现有的血清免疫学方法和以单一PCR技术为主的检测方法其局限性越来越明显,由于不能真实、全面地反映患者体内病毒基因组的各种变异和动态变化,对患者个体的针对性诊断和治疗也受到很大限制。为及时将肝炎病毒的基因研究成果应用于临床实践,需要利用新的分子生物医学技术,研究和开发肝炎病毒的新型诊断方法和诊断试剂。据此,我们重点研究了HBV和HCV基因诊断芯片的制备、应用,以及新型肝炎病毒SENV的实验研究。 本文涉及的实验方法包括生物信息学分析(即芯片上探针和PCR引物的设计、测序序列的检索和比对)、探针和PCR引物的合成、PCR产物直接测序、基因芯片上探针的点样制备方法、血清中病毒的提取方法、PCR扩增和地高辛标记、分子杂交及显色、芯片杂交结果的数据处理等。芯片制备过程中的优化环节包括:尼龙膜型号和探针固定照射剂量的选择,探针3′末端加尾碱基数的确定,利用探针的互补寡核苷酸序列和部分PCR产物的测序验证芯片杂交的特异性,利用PCR扩增直接参入地高辛信号分子,分析其长度、浓度及杂交时间对杂交信号的影响,比较了HBV标本的不同处理方法和不同PCR引物组合的扩增效率。经过二年多的反复实验研究,初步完成HBV基因芯片、HCV基因芯片和HBV、HCV联检芯片的制备。 在HBV基因芯片的研制过程中,先后制备了HBV-450S、HBV-90S、HBV-120S、HBV-P/S区75S和HBV-C/X区25S等不同点阵数的基因芯片。最早的HBV-450S芯片包含的基因信息最丰富,理论上可检测HBV的7种基因型、4种血清亚型、4个P基因耐药相关的突变位点、2个S抗原突变位点、6个C区变异和X区的缺失突变,但部分探针特异性较差。在随后的改进中,HBV-P/S区75S是目前临床实验研究较好的芯片,对基因型、血清亚型和拉米夫定耐药突变均能特异检测。同时,利用制备的HBV基因芯片,对45例纳入葛兰素威康公司评价新药拉米夫定疗效临床研究的乙肝患者、270例三中心医院的门诊慢性乙型肝炎患者和466例来自6个
【学位单位】：南开大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R346
【部分图文】：
一．基因芯片实验体系的优化1．基因芯片的制备和杂交条件的选择利用本文设计的 HBV 寡核苷酸探针和对应 PCR 引物，对基因芯片制作过程实验环节进行优化，包括微阵列制备、选择尼龙膜、探针加尾方式、膜的照和杂交时间的选择等步骤，建立了一套具有自主知识产权的基因芯片操作①尼龙膜的选择。最初实验时我们只利用一家公司的膜和 TDT 末端转移酶备芯片微阵列，但发现显色结果不稳定，促使我们购买 4 种尼龙膜进行实验涉及商业开发，暂且将 4 种膜编号 N1、N2、N3 和 N4 型。多次反复杂交结括手点膜）验证 N4 型膜效果最好，杂交结果最稳定。部分结果见图 1。
3-D1 3-D2 3-E1 3-E2图 3. 不同照射剂量和杂交时间对芯片杂交的影响A～E 代表 5 个 PCR 标记产物（产物量经电泳和测 OD 值后调整为一致浓度）对不同照射剂量的两张膜（HBV-120S 芯片）背对背在同一杂交代内的杂交结果。A1 和 A2 的照射剂量分别 2 倍、3 倍，杂交时间 1hr；A3 和 A4 的照射剂量分别 2 倍、3 倍，杂交时间 2hr；B1 和 B2的照射剂量分别 4 倍、5 倍，杂交时间 4hr；C1 和 C2 的照射剂量分别 6 倍、7 倍，杂交时间过夜；D1 和 D2 的照射剂量分别 9 倍、18 倍，杂交时间 4hr；E1 和 E2 的照射剂量分别 11 倍、15倍，杂交时间 2hr。
484-E1 4-E2图 4. 不同引物组合和处理方法的 PCR 扩增产物电泳图A1～B2 为 S/P 区的 20 对引物 PCR 扩增，使用 107标本进行 PCR 扩增，A1、A2 为浩源公司的碱裂解法，B1、B2 为自配煮法裂解液③。C 为 S/P 区的 5 对引物扩增，前 5 个电泳条带为自配煮法裂解液③，后 5 个电泳条带为血清直接煮法。D1～E2 为 C/X 区的 15 对引物 PCR 扩增，使用 107标本进行 PCR 扩增，D1、D2 为浩源公司的碱裂解法，E1、E2 为自配煮法裂解液③。
【参考文献】
本文编号：2837362
【学位单位】：南开大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R346
【部分图文】：
一．基因芯片实验体系的优化1．基因芯片的制备和杂交条件的选择利用本文设计的 HBV 寡核苷酸探针和对应 PCR 引物，对基因芯片制作过程实验环节进行优化，包括微阵列制备、选择尼龙膜、探针加尾方式、膜的照和杂交时间的选择等步骤，建立了一套具有自主知识产权的基因芯片操作①尼龙膜的选择。最初实验时我们只利用一家公司的膜和 TDT 末端转移酶备芯片微阵列，但发现显色结果不稳定，促使我们购买 4 种尼龙膜进行实验涉及商业开发，暂且将 4 种膜编号 N1、N2、N3 和 N4 型。多次反复杂交结括手点膜）验证 N4 型膜效果最好，杂交结果最稳定。部分结果见图 1。
3-D1 3-D2 3-E1 3-E2图 3. 不同照射剂量和杂交时间对芯片杂交的影响A～E 代表 5 个 PCR 标记产物（产物量经电泳和测 OD 值后调整为一致浓度）对不同照射剂量的两张膜（HBV-120S 芯片）背对背在同一杂交代内的杂交结果。A1 和 A2 的照射剂量分别 2 倍、3 倍，杂交时间 1hr；A3 和 A4 的照射剂量分别 2 倍、3 倍，杂交时间 2hr；B1 和 B2的照射剂量分别 4 倍、5 倍，杂交时间 4hr；C1 和 C2 的照射剂量分别 6 倍、7 倍，杂交时间过夜；D1 和 D2 的照射剂量分别 9 倍、18 倍，杂交时间 4hr；E1 和 E2 的照射剂量分别 11 倍、15倍，杂交时间 2hr。
484-E1 4-E2图 4. 不同引物组合和处理方法的 PCR 扩增产物电泳图A1～B2 为 S/P 区的 20 对引物 PCR 扩增，使用 107标本进行 PCR 扩增，A1、A2 为浩源公司的碱裂解法，B1、B2 为自配煮法裂解液③。C 为 S/P 区的 5 对引物扩增，前 5 个电泳条带为自配煮法裂解液③，后 5 个电泳条带为血清直接煮法。D1～E2 为 C/X 区的 15 对引物 PCR 扩增，使用 107标本进行 PCR 扩增，D1、D2 为浩源公司的碱裂解法，E1、E2 为自配煮法裂解液③。
【参考文献】
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本文编号：2837362
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