正痘病毒检测基因芯片的研制研究

发布时间：2020-10-12 04:42

　　 痘病毒是自然界最大的病毒，其中最著名的成员是曾给人类带来深重灾难的天花病毒，属于痘病毒科正痘病毒属。在正痘病毒属还有另外几种病毒对人具有一定的感染性，如痘苗病毒、牛痘病毒和猴痘病毒。天花早在上世纪七十年代末就已灭绝，相关方面的研究目前在国内几乎是空白。但近年来恐怖主义的肆虐行径使人们认识到生物武器的威胁依然存在，天花病毒仍然是最有可能用作生物武器的病原体。而且随着基因工程技术的发展，其它正痘病毒也可能被改造而具有相似的毒性。对此，除了接种疫苗等预防措施，进行该类病毒基因水平上的早期检测十分重要。 基因芯片在病原体检测方面具有独特的优势，它以高通量并行检测基因的方式，使病原体在感染初期还未引起明显的机体反应的时候被检出，具有快速、高效、敏感、经济和自动化的特点，尤其适宜于大规模的样本检测。 鉴于正痘病毒普遍具有的对人的感染性，对该类病毒进行检测基因芯片的研制十分必要。目前此类病毒在我国很少存在，本研究克服样品缺乏的难题，从寡核苷酸芯片的设计入手，根据正痘病毒的基因同源性，通过BLAST和痘病毒异源同功基因分析，寻找其保守序列，并进行了基因序列比对工作，在此基础上根据寡核苷酸探针原则设计并合成探针，制备了探针序列已知的寡核苷酸芯片，用于此类病毒的检测。同时在体外培养正痘病毒的典型代表痘苗病毒，采用RD方法标记了不同感染时段病毒DNA，与芯片杂交，对该芯片进行了应用验证。标记的牛痘病毒DNA与芯片杂交也有明显的杂交信号，进一步验证了该芯片用于正痘科病毒检测的可行性。 痘苗病毒作为痘病毒的最佳研究对象，其体外感染为我们探索正痘病毒侵染机制提供了良好的研究模型。该病毒在基因表达方面的特点是不依赖于宿主系统，自身进行几乎所有基因的转录，有一套独立的转录系统。其基因表达呈现明显的时段性，分为早期基因和晚期基因。早期基因产物多用于病毒DNA复制；晚期基因产物则在病毒成熟和感染宿主方面起着重要作用。进入宿主细胞之后，病毒粒子完整的转录系统首先产生早期 mRNA，包括用于DNA复制和晚期基因表达的酶和其它因子。晚期mRNA 主要编码病毒粒子蛋白，也包括早期转录因子的两个亚基。对具体功能的 研究通常采用构建突变体和回复突变体的方法进行。目前对这些基因的研 究还不是很充分。本研究利用基因芯片在表达谱应用方面的优势，构建了 痘苗病毒基因文库，从克隆片段中采用巢式PCR方法扩增探针，制备了 基因芯片，在病毒感染细胞后3小时和6小时分别提取总RNA，逆转录 cDNA后采用RD技术进行标记，通过对不同感染时段病毒基因表达谱的 分析，鉴定了7个早期基因和n个晚期基因，为进一步研究这些基因的 功能打下了基础。
【学位单位】：第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R346
【部分图文】：

着孵育时间的延长，病毒繁殖增加，细胞被病毒感染的情况加剧，蚀斑增多、扩大，细胞发生崩溃。图1一4正常143TK一细胞Fig.1一4143TK一eell图1一5病毒感染12hr后的143TK--细胞Fig.1一5143TK一eell;墓/2hrPost一infeetionby沧ee1’Dj日virus图1一6痘苗病毒感染16hr后143TK一细胞Fig.1一6143TK一eell16hrPost一infeetionbyVacej刀1’avirus图1一7痘苗病毒感染24hr的后的143TK一细胞Fig.1一7143TK一eell24hrPost一infeetionby吃cc劲了avirus

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着孵育时间的延长，病毒繁殖增加，细胞被病毒感染的情况加剧，蚀斑增多、扩大，细胞发生崩溃。图1一4正常143TK一细胞Fig.1一4143TK一eell图1一5病毒感染12hr后的143TK--细胞Fig.1一5143TK一eell;墓/2hrPost一infeetionby沧ee1’Dj日virus图1一6痘苗病毒感染16hr后143TK一细胞Fig.1一6143TK一eell16hrPost一infeetionbyVacej刀1’avirus图1一7痘苗病毒感染24hr的后的143TK一细胞Fig.1一7143TK一eell24hrPost一infeetionby吃cc劲了avirus
【引证文献】

相关博士学位论文 前1条

1 马孟根;猪源致病性沙门氏菌耐药基因PCR和基因芯片检测技术研究[D];四川大学;2005年

本文编号：2837659