形成三链DNA的寡核苷酸抑制内皮细胞TF表达的实验研究

发布时间：2020-10-13 15:14

　　 脑血栓形成是最常见的脑血管疾病之一。常常分布在脑血管相对狭 窄、弯曲、分叉或动脉粥样硬化斑块的溪谷处。该疾病所引起的脑梗塞治 疗效果差、病残率高，因此目前趋向于以预防血栓形成为主。血栓形成的 三要素包括：血管壁异常、血液成分改变及血流异常。针对在这些异常因 素，只有抗血小板聚集药物-阿司匹林和噻氯匹啶（ticlopidine）对预防 脑血栓形成有一定疗效。经大规模临床双盲对比试验证实，其有效率约 20～30％。因此如何提高预防脑血栓形成的有效率成为目前的研究热 点。 在心瓣膜病合并房颤时使用阻止纤维蛋白形成的抗凝药物（如肝素 和华法令），可降低缺血性脑血管病发病率68％～86％。说明抗凝药物预 防血栓形成具有显著疗效。然而上述抗凝药物易并发严重的出血副作 用，临床使用时需要严格监测出凝血时间，使用不方便，未能推广 应用于预防脑血栓形成所致的缺血性脑血管病。 近年来，组织因子（Tissue factor，TF）在促凝中的作用日益受到关注。组 织因子是内皮细胞膜上固有的糖蛋白，它与循环中凝血因子Ⅶ相遇，形 成TF-Ⅶa复合物，活化凝血因子X，后者促进凝血酶形成，继之纤维 蛋白形成，导致血液凝固。研究表明正常基础状态下TF在脑、肺、肾、 皮肤及粘膜等重要器官的血管外层细胞大量表达，以在血管破裂时保证重 要器官及时止血。血管内内皮细胞和单核细胞，在基础状态下不表达TF， 使血液和血管外的TF隔离，从而保证血液流动通畅，维持血液循环功能 正常。但在动脉粥样硬化的脑血管分叉或弯曲处，随着局部切应力显著变 化，诱导内皮细胞表达TF，触发局部血管内血栓形成，是触发动脉硬化 血管内血栓形成的主要始发因素之一。因此抑制切应力诱导的TF表达是 提高预防脑血栓形成效果的主要途径之一。 控制人 TF表达的 TF基因位于 1号染色体门 pZI—22人 CDNA全长 2．3 kb。其TF基因启动子的3个Spl肥gr刁位点，是切应力诱导启动TF 基因转录的特异调节元件，即切应力反应元件（shear stress resPonsive element，SSRE人该元件在切应力显著降低、升高或紊流时与切应力诱导 产生的转录因子 Egr4和 Sp结合而激活，继之启动 TF基因表达。因此， SSRE与转录因子Egr二和Spl结合是切应力诱导内皮细胞TF基因表达 的关键环节之一。可见阻断SSRE激活对于抑制切应力诱导的TF基因表 达具有重要意义。 反基因技术所利用的形成三股螺旋的寡核昔酸krghe helix－forming ，TFOL具有特异性碱基识别能力，能够与线状、松弛环 状及超螺旋状质粒DNA或染色体DNA结合形成三股螺旋结构，阻止靶 DNA与调节蛋白。多聚酶、转录因子、甲基化酶）结合，阻止靶基因转 录、复制及表达。TFO是人工操纵特异基因表达的工具，寡核昔酸经过 修饰后可直接透过生物膜，迅速分布于核内靶基因组。己用于抗病毒、抗 肿瘤等多方面研究。本课题欲设计合成筛选在生理环境中能特异性地内皮 细胞TF基因启动子区SSRE结合的TFO与SSRE结合成三链DNA，阻 止SSRE与切应力诱导的Egr1和Spl结合，从而阻止SSRE激活，导致 TF基因转录不能启动，TF表达因而受到抑制，到达阻断切应力诱导的血 栓形成。本实验针对SSRE的3个即l用grd位点的DNA序列，设计合 成TFO，采用电泳迁移分析筛选亲和性最高的TFO、进行硫代磷酸酯修 饰，通过同位素标记TFO，测定其细胞内的cpm值，确定其透膜性、耐 酶性及亚细胞分布，利用兔疫细胞化学和原位杂交方法结合图像分析，以 及TF促凝活性测定初步确定 TFO的抑制效果，同时利用 F．actin和 G．actin 荧光染色确定切应力作用的可靠性和稳定性。主要结果与结论如下： 1．TF基因启动子区的切应力反应元件门SRE）由3个Sp用grl位 点组成，其中第1位点位于（q5～＊、第二位点位于（七8～80X第3 ·XI· 音“ 位点位于＋56～68卜这些位点的DNA序列符合反基因技术的不典型靶序 列要求，即含有喀唆断点的多聚瞟吟靶序列。根据反基因技术的碱基配对 规则，针对第 1位点的 DNA序列，我们设计合成了 4条 14碱基寡核昔 酸，针对第2位点，设计合成了8条ZI碱基寡核苦酸，针对第3位点， 设计合成了 2条 15碱基寡核昔酸。经过凝胶滞留法（EMSA）筛选，每 个位点分别筛选出 1条 TFO，即第一位点为 TI 4GTa，第二位点为 TZI GTa， 第三位点为T15GTa，可见均为反向GT寡核昔酸。按其亲和力大小排序 为：＊1＊W拙：3．6X IO“‘峋＞T14＊W＊d：1刀X 100M）＞T15＊W＊d：1刀丫 10’M卜将筛选出的 3条反向 GT寡核昔酸进行硫代磷酸酯修饰，其亲和 力较修饰前稍有降低J条硫代反向GT寡核昔酸亲和性排序分别为：Kd：2．3 X10”’M（TZIGTa－ps）＞ Kd：3．8X10”’M（T14GTa－ps）＞ Kd：l．5X10”‘M（T15GTa－ pS）与修饰前比较，其亲和性分别下降6．3、3．8、0．5（倍人该结果与其 它相关研究报告结果类?
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2001
【中图分类】：R329.2
【文章目录】：
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中文摘要
论文正文 形成三链DNA的寡核苷酸抑制内皮细胞TF表达的实验研究
    前 言
    第一部分 TFO筛选及其修饰
        材料与方法
        结 果
        讨 论
    第二部分 TFO的细胞摄取率和细胞内分布
        材料与方法
        结 果
        讨 论
    第三部分 切应力对F-actin和G-actin的影响
        材料与方法
        结 果
        讨 论
    第四部分 硫代TFO对TFmRNA转录、蛋白表达及促凝活性的影响
        材料与方法
        结 果
        讨 论
    第五部分 硫代TFO对转录因子Sp1和Egr-1的影响
        材料与方法
        结 果
        讨 论
结 论
致 谢
参考文献
文献综述 形成三链DNA的寡核苷酸对多聚嘌吟靶序列中嘧啶断点的识别
    参考文献
发表的主要文章及论著

【参考文献】

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1 江国伟,孙继虎,王克强,于彦铮,郦鸣阳;应力培养对血管内皮细胞形态结构的影响[J];解剖学杂志;1997年03期

本文编号：2839337