超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3组蛋白的克

发布时间：2020-10-13 02:46

　　 目前，古菌日益引起了科学工作者的广泛关注。它代表了所有最原始 生物形态的分枝，在所有的生命形态中，古菌最接近生命的原始形态。古 菌的发现改变了传统生物分类的界限，提供了一种研究生物进化及生命起 源的新方法。研究表明，古菌在 DNA 复制、转录、翻译等方面与真核生 物相似；而在中央代谢（如产能）方面则与细菌接近。因此，研究古菌不 仅在阐明生命运动的基本规律、物种进化等方面具有重大意义，而且有助 于了解较为复杂的真核生物的一些重要生物学过程。 本文以超嗜热古菌 Pyrococcus horikoshii OT3 为研究对象，根据其遗 传信息，通过生物信息学方法进行分析，预测 Pyrococcus horikoshii 中的 PHS051 基因能够表达一种具有组蛋白生物学功能的蛋白质。由于组蛋白 在进化上十分保守，故其成为研究分子进化的很好的材料。通过对嗜热古 菌组蛋白与大肠杆菌组蛋白以及真核组蛋白 H4 作以同源序列比较分析， 发现古菌组蛋白一级结构及三级结构的保守性，其中保守序列 ELPIAP 是 一个新的蛋白质域，而且仅仅存在于古菌中。 首先进行古菌的小量培养，从中提取染色体 DNA，通过常规 PCR 反 WP=147 应，钓取 PHS051 基因，将这段目的基因重组到质粒 pET11a 中，经酶切 鉴定及序列测定证实目的基因已经成功的插入到质粒 pET11a 中。将重组 质粒转化至感受态细胞 E. coli BL21-Codon Plus 中，构建表达古菌组蛋白 HPhA 的工程菌。但是，已构建的组蛋白工程菌表达率较低，经研究发现 嗜热古菌组蛋白基因序列中精氨酸密码子为 AGG 或 AGA，在大肠杆菌中 的表达率极低，而组蛋白中含有 5 个精氨酸，因此可以肯定精氨酸密码子 是表达率低的主要原因之一。由于精氨酸在古菌组蛋白中分散存在，我们 在传统 PCR 定点突变技术的基础上进行了改进，参照嗜热菌组蛋白基因 序列和大肠杆菌偏爱密码子表，设计了一对含有 5 个精氨酸突变密码子的 单链 DNA，全长为 115nt，在 3’ 端有 20nt 互补序列。将单链 DNA 在 94℃ 变性，45℃复性，使其互补结合，72℃进行延伸反应，得到含有突变位点 的组蛋白基因；再以此基因为模板设计相应的一对引物进行 PCR 扩增反 应，得到大量组蛋白突变基因。将突变基因克隆至表达载体 pET11a，并 转化到宿主菌中，进行重组蛋白 HPhA 的表达，表达量提高约 2.7 倍。 工程菌在 37℃条件下进行培养，IPTG 诱导后降温至 25℃过夜培养， 所得到的菌体经过超声波破碎、热变性、PD-10 柱层析及肝素亲合柱层析 得到 HPhA 纯品。经 Tricine-SDS-PAGE 电泳和高效液相色谱检测表明其 纯度在 90%以上；激光解析电离飞行时间质谱对重组蛋白 HPhA 的分子量 进行了检测，结果为 7860.9Da，与根据氨基酸序列计算的理论值 7868.3Da 基本一致；等电聚焦实验表明 HPhA 的等电点约为 9.07；利用酸水解法对 重组蛋白 HPhA 的氨基酸组成进行分析，结果与理论值基本一致。 在确定了重组蛋白 HPhA 理化性质的基础上，又对 HPhA 的生物学活 性进行研究。HPhA 能够和 DNA 结合，形成 HPhA-DNA 复合物。通过凝 胶迁移率变动分析实验，证明重组蛋白 HPhA 具有提高线形 DNA 在凝胶 电泳中迁移率的作用。HPhA 与 DNA 不同的质量比，表现出的迁移率是 不同的。重组蛋白 HPhA 基因来源于嗜热古菌，因此具有很强的耐热性。 实验表明，HPhA 具有耐高温的特性。特别在高盐条件下（1mol/L KCl）， WP=148 HPhA 在 95℃条件下保温 16 小时，仍然保持与 DNA 结合的活性。重组 蛋白 HPhA 对 DNA 具有一定的的保护作用，具体表现为在适宜的 HPhA 浓度下，可以降低限制性内切酶 TaqⅠ对 DNA 的降解。另外，研究表明 HPhA对线形DNA的Tm值产生影响，可以提高线形DNA的Tm值约20℃。 将组蛋白 HPhA 与嗜热性古细菌组蛋白 HMfB 和嗜中温古菌组蛋白 HFoB 比较后，分析了组蛋白 HPhA 特殊的耐热性，发现并不主要在于其总体的 三维结构，而是由于非保守序列的微小差异导致热稳定性的较大差异。 HPhA 中含有大量的丙氨酸、多电荷残基、芳香类残基和疏水性残基，这 些都是 HPhA 具有极强的耐热性必不可少的因素。目前正在对 HPhA 的 晶体结构进行研究，将提供新的实验数据，并对其耐热机制提出更加合理 的解释。 基因治疗是从 20 世纪 80 年代发展起来的最具革命性的医疗技术。近 十年来，它作为一项全新的疾病治疗手段已经显现出强大的发展势头。“人 类基因组计划”的实施以及所取得的成果，不仅使人类更加清楚地了解自 身，而且为基因诊断和基因治疗的研究、开发与产业化奠定了基础。但是， 基因治疗也存在一些问题，特别是基因载体技术严重限制了基因治疗的发 展。组蛋白作为 DNA 结合蛋白，有可能成为一种有效的基因载体。 因为重组蛋白 HPhA 具有与组蛋白相同的功能，而且稳定性也较好， 有可能作为外源基因的载体。通过实验证实，HPhA 能够与表达质粒稳定 的结合，形成复合物，而且可以有效的降低脱氧核糖核酸酶对外源表达质 粒的降解，起到很好的保护作用。通过体外细胞转染实验，确定了 HPhA 作为基因载体介导转染的最佳方案。为得到
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R346
【文章目录】：
第一章 前 言
    1 基因治疗
        1.1 基因治疗概论
        1.2 基因治疗的策略
        1.3 基因治疗的途径
        1.4 基因治疗的基本程序
        1.5 基因治疗的靶向
        1.6 非病毒基因治疗的研究进展
        1.7 基因治疗中有待解决的关键性问题
        1.8 基因治疗的前景与展望
    2 组蛋白
        2.1 组蛋白在基因调控中的作用
        2.2 组蛋白的修饰
        2.3 组蛋白与染色质的结合
        2.4 古菌组蛋白
    3 立论依据
第二章 HPhA 工程菌的构建及表达
    1 序言
    2 仪器与材料
        2.1 主要仪器
        2.2 实验材料
        2.3 溶液配制
    3 实验方法
        3.1 HPhA 基因的钓取
        3.2 PCR 产物的酶切和纯化
        3.3 质粒载体的限制性酶切、纯化及磷酸化处理
        3.4 目的基因与载体的连接
        3.5 重组质粒的转化
        3.6 单克隆菌株的筛选和鉴定
        3.7 工程菌的复壮及初步放大
        3.8 工程菌生长曲线
        3.9 重组蛋白 HPhA 的诱导表达
        3.10 重组蛋白突变体工程菌的构建
        3.11 重组蛋白突变体工程菌的表达及检测
        3.12 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
    4 结果与讨论
        4.1 古菌组蛋白同源序列比较分析
        4.2 超嗜热古菌组蛋白 HPhA 基因的克隆、酶切及回收
        4.3 表达载体 pET11a 的酶切、回收及去磷酸化处理
        4.4 古菌蛋白目的基因与 pET11a 的连接、转化及鉴定
        4.5 工程菌生长曲线的绘制
        4.6 HPhA 表达宿主菌的选择
        4.7 HPhA 的诱导表达
        4.8 古菌组蛋白 HPhA 突变基因的获得
        4.9 重组 T 载体构建及鉴定
        4.10 古菌组蛋白 HPhA 突变体表达质粒的构建
        4.11 古菌组蛋白 HPhA 突变体表达菌株的构建及表达
    5 小结
第三章 HPhA 的分离、纯化及性质研究
    1 序言
    2 仪器与材料
        2.1 主要仪器
        2.2 实验材料
        2.3 溶液配制
    3 实验方法
        3.1 HPhA 的分离纯化
        3.2 Lorry 法检测蛋白含量
        3.3 重组蛋白 HPhA 纯度检测及分子量的确定
        3.4 重组蛋白 HPhA 等电点的测定
        3.5 重组蛋白 HPhA 的氨基酸组成分析
        3.6 重组蛋白 HPhA 的园二色谱分析
    4 结果与讨论
        4.1 重组蛋白 HPhA 的纯化
        4.2 HPhA 蛋白含量的确定
        4.3 HPhA 的纯化效率
        4.4 Tricine-SDS-PAGE
        4.5 高效液相色谱分析
        4.6 重组蛋白 HPhA 分子量测定
        4.7 重组蛋白 HPhA 的氨基酸组成分析
        4.8 HPhA 等电点的测定
        4.9 重组蛋白 HPhA 的园二色谱分析
    5 小结
第四章 HPhA 与 DNA 相互作用的研究
    1 序言
    2 实验材料
        2.1 菌株和质粒
        2.2 主要试剂
    3 实验方法
        3.1 质粒 pET21a 的制备及纯化
        3.2 重组蛋白 HPhA 对质粒 DNA Tm值的影响
        3.3 重组蛋白 HPhA 与质粒 DNA 结合实验分析
        3.4 HPhA 增强质粒 DNA 抗核酸酶降解的研究
    4 结果与讨论
        4.1 质粒 pET21a 的制备及纯化
        4.2 重组蛋白 HPhA 对质粒 DNA Tm值的影响
        4.3 HPhA 与质粒 DNA 不同质量比对结合活性的影响
        4.4 温度对 HPhA-DNA 结合的影响
        4.5 盐离子浓度对 HPhA 与质粒 DNA 结合活性的影响
        4.6 HPhA 增强质粒 DNA 抗核酸酶降解的研究
        4.7 古菌组蛋白 HPhA 结构分析
        4.8 古菌组蛋白 HPhA 耐热机制的探讨
    5 小结
第五章 HPhA 介导基因转染的研究
    1 序言
    2 仪器与材料
        2.1 主要仪器
        2.2 实验材料
        2.3 溶液配制
    3 实验方法
        3.1 质粒 pCMV β-gal 的制备
        3.2 质粒 DNA-HPhA 复合物的制备
        3.3 凝胶延迟分析
        3.4 质粒降解分析
        3.5 细胞的培养
        3.6 细胞转染
        3.7 MTT 法检测重组蛋白 HPhA 对细胞的毒性
        3.8 染色体基因组的获得
        3.9 HBsAg 基因的扩增
        3.10 克隆载体的构建
        3.11 表达载体的构建
        3.12 质粒的大量提取及纯化
        3.13 重组蛋白 HPhA 介导的瞬时表达
        3.14 HBsAg 瞬时表达的检测
        3.15 重组蛋白 HPhA 介导的乙肝核酸疫苗小鼠免疫实验
    4 结果与讨论
        4.1 质粒 pCMV β-gal 的制备
        4.2 HPhA 的制备
        4.3 凝胶延迟分析
        4.4 质粒降解分析
        4.5 HPhA 与质粒不同的质量比对转染效率的影响
        4.6 细胞汇合度对转染效率的影响
        4.7 保温时间对转染效率的影响
        4.8 钙离子对转染效率的影响
        4.9 不同浓度的血清对转染效率的影响
        4.10 不同细胞株转染效率的比较
        4.11 HPhA 对 Lipofectemine 介导细胞转染效率的影响
        4.12 HPhA 对细胞的毒性分析
        4.13 乙肝病毒表面抗原核酸疫苗的构建
        4.14 质粒的大量提取和纯化
        4.15 重组 HPhA 介导核酸疫苗在 COS 7 细胞中瞬时表达
        4.16 重组蛋白 HPhA 介导乙肝核酸疫苗小鼠免疫
    5 小结
结 论
参考文献
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【引证文献】

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1 李媛媛;超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3组蛋白介导野生型p53基因治疗鼻咽癌的实验研究[D];吉林大学;2007年

本文编号：2838626