特络细胞(telocytes)是近几年新发现的一种间充质来源的间质细胞,由罗马尼亚L. M. Popescu教授在2005年首次确认,并于2010年正式命名。特络细胞已被证实存在于哺乳动物体内几乎各种器官及组织中。特络细胞形态及超微结构与其他间质细胞如成纤维细胞、间充质干细胞等有着显著不同,其具有特征性的串珠样细胞突起,可形成3D网络支架结构。 通过组织学和免疫学的方法已经证实特络细胞表面阳性表达CD34、c-kit、 vimentin,与各种固有细胞如成纤维细胞、免疫细胞、神经细胞等互相接触,参与细胞间的信号转导,尤其是与干细胞关系密切,可能发挥着“干细胞辅助细胞”的功能参与组织的损伤修复过程。但是限于在细胞分离、纯化、培养等方面的诸多困难,对特络细胞功能学的研究非常缓慢,目前大多数研究仅局限于组织学及形态学方面,仅有少数专注于细胞生物学功能方面的研究,而且还只是基于细致的组织学观察而得出的推论和假设,尚缺乏体内、体外的细胞实验进行论证。 我们认为某种细胞的结构及其组织分布特征必然与其功能相适应,因此在现有的研究基础上,本课题应用组织学、细胞分子生物学、基因组学等方法,着重研究特络细胞在肺脏的定位和分布特征,揭示肺脏特络细胞与其他间质细胞的差异,以及与干细胞的联系,阐述其可能的细胞生物学功能,为进一步应用特络细胞治疗肺部疾病奠定理论依据和实验基础。 第一部分 肺脏特络细胞的定位与分离培养 目的： 明确特络细胞是否存在于肺脏中,揭示特络细胞在气管和肺组织中的分布特征,研究特络细胞的形态学特征及体外培养的动态变化。 方法： 通过电子显微镜技术、免疫组织化学技术在肺组织中定位特络细胞；体外分离小鼠/人肺特络细胞,通过原代细胞培养、活细胞染色等观察肺特络细胞的形态结构；通过Cell-IQ活细胞工作站动态观察肺特络细胞在体外培养过程中的形态学变化；采用流式细胞技术分析特络细胞的表面生物标记物。 结果： 扫描及透射电镜在小鼠气管软骨、平滑肌之间的间隙中找到了特络细胞,其胞体带有细长的突起telopode;透射电镜发现特络细胞位于肺间质,紧邻毛细血管及小支气管,在肺干细胞周围存在大量特络细胞。Telopode呈管腔样结构,厚薄交替。免疫组化证实特络细胞是CD34、c-kit、vimentin阳性细胞。从肺组织中分离、培养的细胞具有典型的特络细胞特征。流式细胞检测分析发现,人肺特络细胞表面CD44, CD73, CD90, CD105为阳性,CD34、CD11b、CD19、CD45、 HLA-DR表型结果均为阴性,与人骨髓间充质干细胞表型一致。体外细胞培养96小时的连续动态观察提示特络细胞具有游走性、趋化性,细胞间可形成网状结构,可释放颗粒物质,也可以吞噬其他特络细胞释放的颗粒物质。 结论： 气管和肺组织中也广泛存在特络细胞,其分布具有特征性,参与小血管和小支气管的支架结构,与肺泡上皮细胞以及肺干细胞关系密切。人肺特络细胞与人骨髓间充质干细胞表达相同的生物标记物,特络细胞具有干细胞的特性。特络细胞之间可以形成网状结构,可能参与细胞间的信号传递。 第二部分肺脏特络细胞与纤维细胞、间充质干细胞的基因差异分析 目的： 探索特络细胞与其他间质细胞之间的基因差异,找出其特异性表达的基因,明确特络细胞是否为一类新的间质细胞。 方法： 分离、培养小鼠肺特络细胞,与小鼠肺成纤维细胞、骨髓间充质干细胞一起分别做全基因表达谱分析,对比三种细胞之间的基因表达,寻找其中的差异基因和共表达基因。 结果： 与小鼠成纤维细胞、骨髓间充质干细胞相比较,小鼠特络细胞有2000个基因高表达,有超过4000个基因低表达。在这数千个基因中,三种细胞共同表达的基因有156个,进一步通过String Network分析发现其中又有46个基因之间有不同程度的关联性,而小鼠特络细胞特异性表达Rbp1基因。差异基因主要体现在细胞的发生、生长过程,解剖与形态结构等方面。 结论： 特络细胞的基因表达与成纤维细胞、骨髓间充质干细胞差异巨大,尤其是特异性表达Rbp1基因。特络细胞是一类新的间质细胞 第三部分 肺脏特络细胞对血管内皮细胞的损伤修复作用 目的： 探索特络细胞是否能够合成分泌与血管生成相关的细胞因子,研究特络细胞是否能促进血管内皮细胞的增殖,促进血管内皮细胞的损伤修复。 方法： 分离、培养小鼠/人肺特络细胞,分别培养24、48小时,用ELISA法检测细胞培养上清液中细胞因子VEGF, EGF, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF, MCP-1, TIMP-1, TIMP-2水平；分别以DMEM完全培养基和特络细胞条件培养基培养人肺微血管内皮细胞,检测细胞增殖能力；以脂多糖刺激人肺微血管内皮细胞,分别以DMEM完全培养基和特络细胞条件培养基培养,用Matrigel胶法检测微血管内皮细胞的小管生成能力。 结果： 小鼠/人肺特络细胞培养上清液中与血管生成相关的细胞因子水平升高,尤其是VEGF、EGF。与对照组相比,人肺特络细胞条件培养基提高了人肺微血管内皮细胞的增殖能力；与对照组相比,人肺特络细胞条件培养基促进了LPS损伤后的人肺微血管内皮细胞的小管生成能力。 结论： 特络细胞可以分泌VEGF、EGF,促进血管内皮细胞的增殖和损伤修复。
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：
特络细胞被成功的从肺组织中分离并体外培养，培养3-4天后可以在普通光学显微镜下观察到典型形态特征（图5:①)。在不同的染色条件下，细胞显示出相同的形态特征。亚甲基蓝染色（图5:②）和吉姆萨染色（图4:③）显K telopode很长，从细胞胞体延伸出去，管腔H凸不平，远端逐渐变细；薄厚相间，如同念珠状。詹姆斯绿B是一种活细胞染料，与细胞内线粒体有很高的结合力，因此常被用来定位线粒体。活细胞染色发现，特络细胞胞体及telopode富含线粒体（图5:④）。线粒体绿色焚光探针常被用于鉴定细胞内的线粒体,通过对细胞的标记，可见特络细胞胞体及telpode中富含线粒体，提示线粒体占了大部分体积，因此特络细胞可能是一个“巨大的动力工厂”（图5:⑤、⑥)。图5:小鼠肺脏原代培养的特络细胞(TC)细胞及其突起telopodeCTp)
【共引文献】
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