对BMP-9诱导成骨、成脂肪作用的调节研究

发布时间：2020-10-14 10:16

　　 目的： 1．通过AdEasy系统和piggyBac系统构建腺病毒载体和基因稳定高表达细胞株，从而建立起稳定、高效的目的基因调控方法。 2．通过腺病毒载体和基因稳定高表达细胞株研究BMP-9和Nell-1基因在成骨、成脂肪方面的相互作用，从而明确Nell-1基因对由BMP-9诱导的成骨和成脂肪作用的影响。 3．通过腺病毒载体调节Creld2基因表达，通过观察成骨指标的改变明确Creld2在BMP-9诱导的成骨过程中的调节作用。 方法： 1．构建Nell-1基因腺病毒载体：通过Hi-Fi PCR扩增Nell-1基因全序列后将其包装入质粒，随后利用AdEasy系统在HEK293细胞中包装Nell-1基因相关腺病毒载体，利用荧光、RT PCR以及功能检测明确其作用。 2．构建Nell-1基因稳定高表达细胞株：利用piggyBac系统将质粒中的Nell-1基因全序列转座进间充质干细胞基因组中，通过RT PCR和相关功能检测明确Nell-1基因表达上调。 3．Nell-1基因对BMP-9功能影响：通过腺病毒载体和稳定高表达细胞株进行RT PCR分析成骨和成脂肪相关基因的表达，测定碱性磷酸酶活性和钙结节染色、油红O染色以及动物实验与细胞周期分析检测Nell-1基因对BMP-9诱导成骨、成脂肪作用的影响。 4．Creld2基因对BMP-9成骨功能的调节：通过腺病毒载体改变Creld2基因的表达，并对碱性磷酸酶活性、成骨标志基因的表达以及钙盐沉积等方面进行检测，最后利用动物实验分析Creld2对BMP-9诱导的成骨作用的影响。 结果： 1．腺病毒载体和稳定细胞株：腺病毒载体能够感染细胞并表达相应荧光，通过收集腺病毒载体感染后的细胞总RNA以及稳定高表达细胞株的总RNA，进行RT PCR后证实目的基因表达能够被有效调节，同时进行ALP染色等功能试验与对照组也有明显差异。 2．Nell-1基因对BMP-9的功能影响：（1）在体外实验中Nell-1基因无法有效诱导间充质干细胞分化，但与BMP-9联合作用后，能够抑制由BMP-9诱导的ALP表达，但钙盐沉积明显增强并能抑制由BMP-9诱导的成脂肪作用，当Nell-1基因受到抑制时BMP-9诱导的成脂肪作用明显加强。（2）在动物实验中Nell-1无法有效诱导异位成骨，但与BMP-9合用后较BMP-9单独作用虽然包块体积略小但密度更高，染色显示骨小梁更为粗壮、成熟，同时脂肪组织更少。 3．Creld2基因对BMP-9成骨功能的调节：（1）在体外实验中当Creld2基因表达上调时，由BMP-9诱导的成骨标志明显表达明显上升，但当Creld2表达受到抑制时，成骨作用明显减弱。（2）在动物实验中，Creld2与BMP-9联合组包块较BMP-9单独组更大且骨小梁成分更多，当Creld2被抑制由BMP-9诱导的成骨效果明显变差。 结论： 1．通过AdEasy系统和piggBac系统制作腺病毒载体和稳定高表达细胞株能够有效调节目的基因的表达。 2．Nell-1基因能够增强由BMP-9诱导的成骨作用，并能抑制其诱导的成脂肪作用。 3．Creld2对BMP-9诱导的成骨起关键调节作用。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R363
【文章目录】：
符号说明
摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 构建 Nell-1 基因相关腺病毒和稳定细胞株
    1 材料与方法
    2 实验结果
    3 讨论
第二部分 Nell-1 基因对 BMP-9 诱导成骨、成脂肪的影响
    1 材料与方法
    2 实验结果
    3 讨论
第三部分 Creld2 基因对 BMP-9 成骨的调节作用
    1 材料与方法
    2 实验结果
    3 讨论
结论
参考文献
文献综述
    参考文献
引物序列
致谢
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【参考文献】

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1 李红玲;朱敏佳;党怀欣;王保国;朱毅;;ATF6调节ABCA1基因的表达[J];中国生物化学与分子生物学报;2006年10期

本文编号：2840539