人PGCs来源的EBD细胞向人心肌细胞分化的实验研究

发布时间：2020-10-15 12:24

　　 目的：旨在从人的胚胎生殖基中分离出人胚胎生殖脊细胞(hPGCs)，进行体外培养，并证实hPGCs是具有多分化潜能的干细胞；再从hPGCs中得到类胚体(EB)，在EB中得到多分化潜能的干细胞(人EBD细胞，hEBDs)；将hEBDs植入到体内，观察hEBDs在心肌中能否分化为人心肌细胞，以便为hEBDs在心血管方面的研究与将来在临床上用于冠心病的治疗提供理论基础与实验依据。 方法：(1)从发育5—7周的人肝胎中分离hPGCs，在体外接种于小鼠STO细胞中，进行体外培养；(2)通过形态学、AKP活性测定及细胞表面标志物SSEA-4与TRA-1-60分析对hPGCs进行鉴定；(3)通过悬浮培养得到类胚体(EB)，从EB中得到多分化潜能的hEBDs，并运用RT-PCR进行鉴定；(4)采用显微注射法，将DAPI标记的hEBDs注射到发育第4天的鸡胚心肌中；(5)运用人特异性的Alu探针对人、小鼠、大鼠、鸡、兔、狗、羊及猪心肌进行DNA原位杂交，以证实Alu探针的人特异性；(6)运用Alu探针DNA原位杂交在术后存活的鸡胚心肌中检测人细胞的存在；(7)运用免疫荧光技术分析人细胞阳性的鸡胚心肌相邻切片有无人心肌特异性的标志物ANP、cTnT及Nkx-2.5存在；(8)运用RT-PCR检测移植hEBDs的鸡胚心肌中有无人心肌特异性的标记物MLC-2V、MLC-2A、-MHC、CTnT、ANP与NKx-2.5等存在。 结果：(1)从发育5—7周的人胚胎中分离出hPGCs，在体外能连续传代；(2)hPGCs在体外能形成克隆，有AKP活性，存在SSEA-4与TRA-1-60表达；(3)通过悬浮培养hPGCs形成EB，消化EB，得到hEBDs，RT-PCR显示hEBDs表达Myf5、GFAP与α-FP；(4)Alu探针DNA原位杂交在人心肌阳性，而小鼠、大鼠、鸡、兔、狗、羊及猪心肌均阴性；(5)Alu探针DNA原位杂交显示，在注射hEBDs的术后活的鸡胚心肌中，有人细胞存在；(6)免疫荧光显示存在人细胞的鸡胚心肌相邻切片中有人心肌特异性的标志物ANP、cTnT及Nkx-2.5存在；(7)RT-PCR显示，移植hEBDs的鸡胚心肌中有人心肌特异性的基因MLC-2V、MLC-2A、-MHC、CTnT、ANP与NKx-2.5等表达。 结论：(1)从人胚胎生殖基中分离出hPGCs具有多分化潜能，进行体外培养能够得EB，由EB得到的hEBDs也有多分化潜能；(2)hEBDs在体内能分化为人心肌细胞，是细胞移植治疗冠心病的新的细胞来源。
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

心肌;5为第12代的EBD细胞;6为注射EBD细胞的鸡胚心肌，7为人心肌;8为为未注射细胞的鸡胚心肌;MLC一ZV与MLC一ZA的分子量分别为382bp与381bp图3一14Rl’-pCR:M为100bp的参照物(Marker);1一4为eThT，5一8为a一MHC;其中1为注射EBD细胞的鸡胚心肌;2为人心肌;3为第12代的EBD细胞，4为鸡胚心肌;5为注射EBD细胞的鸡胚心肌;6为人心肌;7为未注射细胞的鸡胚心肌鸡胚;8为第12代的EBD细胞。cTnT与a一MHC的分子量分别为巧0bp与413bp图3一15Rl二pCR:M为100bp的参照物(Marker);1一4为Nkx2.5，5一8为ANp;其中1为人心肌;2为注射EBD细胞的鸡胚心肌;3为第12代的EBD细胞，4为鸡胚心肌;5为注射EBD细胞的鸡胚心肌;6为人心肌;7为未注射细胞的鸡胚心肌鸡胚;8为第12代的EBD细胞。ANP与Nkx2.5的分子量分别为406bp与233bP

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【参考文献】

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本文编号：2842167