骨髓源性ips神经前体干细胞的制备、定向分化为功能神经细胞的体外实验研究

发布时间：2020-10-16 03:06

　　【研究背景及目的】骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是来源于中胚层的骨髓非造血干细胞,具有很强的自我更新和多向分化潜能。一直以来,许多研究都在尝试诱导中胚层的MSCs向上皮层的神经元转分化,方法包括:细胞因子诱导、与神经细胞共培养、基因转染、化学物质诱导等。然而MSCs跨胚层分化为神经细胞的效力不高、比例低下、缺乏神经电生理功能、无法满足临床及科研的需要,限制了MSCs移植治疗中枢神经系统损伤的临床应用。诱导式多潜能干细胞再程序化技术,是指通过植入新的转录调控基因,改变细胞的发育“记忆”,使其返回到最原始的胚胎发育状态,并具有向各胚层分化的潜能。因此,本课题拟采用慢病毒转染技术将在神经分化中起关键作用的转录因子Neurogenin2(Ngn2)转入大鼠MSCs,使细胞再程序化为骨髓源性ips神经干细胞,再经诱导定向分化为功能神经元;并初步探索MSCs跨胚层分化的内在分子机制,为进一步研究提供理论依据。【研究方法】 1.大鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定,携带Ngn2慢病毒液的制备及细胞转染。 2.无菌条件贴壁法培养大鼠MSCs,扩增至第3代为实验用,流式细胞仪鉴定大鼠骨髓间充质干细胞标记物。构建基因重组慢病毒载体,插入绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为标记。使用高效重组载体和含有目的基因Ngn2的质粒共转染293T细胞,进行病毒包装和生产,收集病毒液后转染MSCs。 3.细胞因子诱导Ngn2转染的MSCs向神经细胞分化、鉴定。Ngn2转染的MSCs,先给予含bFGF +EGF的无血清DMEM培养基培养,3天后待大部分细胞长成接近神经细胞样克隆,然后在细胞培养液中加入BDNF作神经诱导和分化。免疫细胞化学、神经电生理,用以鉴定分化成的神经细胞是否具有神经细胞功能。 4.大鼠骨髓间充质干细胞转分化为神经元的相关机制研究已知JAK-STAT3 signaling, ERK signaling, JNK signaling等信号通路与神经元分化密切相关,采用western blot分别检测转基因前、后,及因子诱分化后的神经分化相关信号通路关键蛋白的表达,探索大鼠MSCs神经分化的内在分子机制。【研究结果】 1.体外贴壁法培养大鼠MSCs,细胞贴壁生长、生物特性良好、传代稳定。流式细胞仪鉴定结果示:CD34 (-), CD45(-) ,CD44(+) ,CD105符合间充质细胞特性。制备含目的基因Ngn2的慢病毒液,滴度为1×108TU/ml,转染大鼠MSCs效率达93%左右。转染Ngn2基因后的MSCs在培养液中继续增殖,细胞克隆形态无明显异常改变。且表达神经前体干细胞标记物如:Nestin、Pax6、Vimentin、Musashi1。 2.骨髓源性ips神经干细胞在体外促神经分化因子作用下,细胞呈神经元样形态、免疫细胞化学检查发现,细胞表达成熟神经元相关标记物:MAP2, NeuN, NSE,Western blot蛋白定量检测也证实了免疫细胞化学结果,膜片钳电生理也在记录到且具有神经元动作电位相关Na~+离子、K~+离子通道。3.Western blot蛋白定量检测表明,经神经分化因子诱导后,骨髓源性ips神经干细胞中磷酸化STAT3蛋白表达明显低于正常水平,而磷酸化ERK、JNK蛋白表达升高。【研究结论】 1.Ngn2基因转染大鼠骨髓间充质干细胞,可成功制备出骨髓源性ips神经干细胞,并可诱导分化为具有神经电生理功能的神经元细胞。 2.骨髓源性ips神经干细胞跨胚层分化为功能神经细胞的分子机制,可能与抑制STAT3、增强ERK、JNK表达的信号通路有关。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R329
【部分图文】：

间充质干细胞,类似形,成纤维样细胞,漩涡

17源性ips神经前体干细胞（P<0.05）。（图4，5）◆ 图1， P3代培养的大鼠骨髓间充质干细胞，细胞呈长梭形，成纤维样细胞，完全融合后类似形成漩涡壮结构（倒置显微镜×400）CD45-FITC(-) CD34-PE(-)CD44-PE(+) CD105FITC(+)◆ 图2 流式细胞仪检测结果显示，通过贴壁法培养的大鼠骨髓间充质干细胞表面标记蛋白CD34 、CD45 表达阴性;而间充质干细胞相对特异性标志蛋白CD44，CD105强阳性表达。

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