白纹伊蚊对登革病毒细胞内免疫的研究

发布时间：2020-10-17 07:01

　　 登革热是由登革病毒引起，经媒介伊蚊传播，在世界上流行最广泛的一种虫媒病毒性疾病。控制媒介伊蚊是防治DF最有效的方法，但传统上控制登革热媒介的措施存在许多局限性，转基因技术的出现为蚊媒疾病的防治提供了一个新的思路。本研究扩增和克隆登革病毒C基因和prM基因，构建了昆虫表达载体pBhspEGFP，将prM基因以3种不同表达形式重组入昆虫表达载体，Western Blot和荧光显微镜观察证明在白纹伊蚊C6／36细胞中成功表达了prM-EGFP融合蛋白。转染重组质粒后C6／36细胞表现出对登革病毒入侵的抵抗性，从而复制出C6／36细胞对登革病毒的细胞内免疫现象。发现无论是否表达prM蛋白，只要有prM基因转录可引起细胞内免疫现象；prM基因正义和反义转录形式均可诱导细胞内免疫；并探讨其形成机制可能是通过RNA干扰作用而产生。构建了以转座子piggyBac因子为基础的转基因载体pB[PUBnls EGFP-prM]，PCR和Southern Blot证明构建的转基因载体可以将EGFP-prM基因整合入在蚊虫基因组中。验证了转座子piggyBac因子、启动子polyubiquitin可以在白纹伊蚊中发挥作用，为进一步构建不传播登革病毒的转基因白纹伊蚊奠定了基础。
【学位单位】：中山大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2002
【中图分类】：R384.1;R392
【部分图文】：

2.2质粒pEGFp一3的Ndel和Bgl11双酶切质粒pEGFp一N3的Ndel和Bgl11双酶切后产生与设计相符的377Pb和4.3kb两个片段(见图4)。图4质粒pEGFP一N3双酶切后1.0%凝胶电泳图Fig4.ResrtietionnaalysisofPlasmidPEGFP一N3(1.0%gaarosegeleleeortPhoresis)LnaeMI，MZstnaddarweightmarker，Lnael，2.PrMgenereeombinantundigestedPlasmid，Lnae3，4PlasmiddigestedbyNdel和Bgl112.2质粒phspBac的Apal和EeoRI双酶切质粒phPsBac的APal和EocRI双酶切产物在1.0%凝胶电泳中呈现在580bp和5

pB[hspEGFP]的测序鉴定化大肠杆菌JM109后，分别挑取3个克明3个克隆中有2个启动子hsp7o呈正向插入。式pMr的表达载体pBlhsp一prM一EGFPIfs、pMr一uft、pMr一nati分别与pMr一bf配合电泳显示pMr一ofs、pMr一uft、pMr一nati分0bp的扩增带。

BPnati经APal和助刀工双酶切产生550Pb的插入片段，与PrM基因相符。以重组质粒为模板做PRC鉴定，均扩增出与设计大小相符的基因片段(见图7)。因此证明所获得的重组质粒已成功地插入了目的基因。图7重组质粒的PCR和酶切鉴定Fig2.PCRnadRestrictionanalysisofreeombinnatPlasmid(1.2%gaarosegelelecrtoPhoersis)LnaeM1.stnaddarweightmkarerLnael，2.PCRnaalysisnadResrtietionnaalysisereombinnatPlasmidPBPrM，Lnae3，5PCRnaalysisnadResrtictionnaalysisercombinnatPlasmidPBunt，Lnae4，6PCRnaalysisandRestrietionanalysisereombinnatPlasmidPBnati4.不同表达载体pBlbsp一PrM一EGFPI在白纹伊蚊细胞C6136中的表达4.1转染细胞的总RNA提取提取的蚊虫细胞总NRA经1.2%的琼脂糖凝胶电泳显示清晰的185、285两条泳带，证明NRA完整无降解(见图8)。
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本文编号：2844456