肺部免疫反应和血管重塑中重要转录事件调控机制的研究

发布时间：2020-10-17 11:10

　　 第一部分 肺成纤维细胞中腺苷信号抑制CIITA介导的MHC II反式激活 目的：通过主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子的高效的抗原递呈反应，是获得性免疫中的一个核心环节。MHCII类反式激活蛋白启动子IV（CIITA）被认为是调控MHCII基因转录的起始最重要的调控子。在我们早期的研究中，我们发现在A2b腺苷受体缺陷的肺成纤维细胞中CIITA表达上调。因此我们得出腺苷受体激动剂NECA可以通过抑制CIITA介导MHC II的反式激活的假说。 方法：在本研究中，我们首先用腺苷受体激动剂（adenosine-5'N-ethylcarboxamide，NECA）处理肺成纤维细胞（IMR-90）来观察激活了腺苷信号通路后是否能有效抑制MHCII的表达。然后我们通过抑制选择性腺苷受体激动剂MRS-1754从而观察其是否可以恢复CIITA依赖性的MHCII的转录。染色质共沉淀的方法观察IFN-γ处理后CIITA是否可以增加与HLA-DRα启动子区域的结合，而ΝΕCA可以抑制CIITA与HLA-DRα启动子区域的结合。Forskolin作为腺苷酸环化酶激动剂与NECA可以发挥同等作用。A2b信号通路通过改变组蛋白修饰以及对于III型和IV型启动子关键因子的集合来抑制CIITA的转录，并且该调控作用是STAT1依赖性的。为了进一步研究STAT1在腺苷信号通路的作用，我们用shRNA的方法然后观察RNA聚合酶II和Brg1是否在CIITA的启动子富集以及组蛋白乙酰化的改变。最后我们观察了MRS-1754抑制肿瘤生长因子（TGF-β）的拮抗作用是否能通过免疫反应性纤维结合素（IFN-γ）所介导的CIITA的表达。 结果：肺成纤维细胞中，腺苷信号通路能够通过A2b受体抑制CIITA所介导的MHCII转录水平，Forskolin能够激活腺苷酸环化酶从而抑制CIITA介导的MHCII的转录，而TGF-β通过腺苷信号通路抑制CIITA介导的MHCII转录。 结论：腺苷A2b受体-腺嘌呤环化酶信号通路轴可以通过CIITA介导的MHC转录。该结论可以为新的免疫调节机制提供新的思路。 第二部分 平滑肌细胞中SIRT1脱乙酰化RFX5拮抗抑制COL1A2转录机制的研究 目的：动脉中样硬化斑块中，血管平滑肌细胞中胶原含量的降低会导致斑块失稳破裂的风险增加。根据此机制抑制I型胶原（COL1A2）可能成为一个预防斑块破裂所带来并发症的潜在靶点。在我们以前的的研究发现X盒（RFX5）的调节子与COL1A2转录起始位置结合能够抑制其转录。SIRT1作为NAD-依赖的组蛋白去乙酰化酶，它能够通过调节组蛋白或者相关转录因子的乙酰化水平参与到众多的生物学过程中去，在本研究中我们拟观察SIRT1作为III型组蛋白脱乙酰酶可以与RFX5形成一个复合物。 方法：通过过表达SIRT1或者NAMPT（能够合成NAD+以激活SIRT1），或者用SIRT1拮抗剂白藜芦醇降低RPEX5乙酰化以及抑制RFX5所介导的COLIA2启动子区活性。此外，我们还在细胞系中敲除SIRT1或者用SIRT1抑制剂处理细胞从而导致RPX5乙酰化以及增加对于胶原转录的抑制。 结果：SIRT1能够通过增加RFX5核转位以及蛋白酶体的降解从而减弱其与COL1A2启动子区域的结合能力，最终拮抗RFX5活性。促炎因子IFN-γ在平滑肌细胞中可以抑制COL1A2的转录，其可能的机制亦是通过降低SIRT1表达。 结论：脱乙酰酶（SIRT1）在平滑肌细胞中调节了COL1A2的转录活性，靶向作用脱乙酰酶可能成为潜在的抗动脉粥样硬化治疗的策略。因此，我们的研究为临床上对动脉粥样硬化进行干预提供了潜在的靶位点。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R3411
【部分图文】：

在肺成纤维细胞中腺苷信号通路抑制 MHCII 转录。-90 细胞分为ΙFΝ γ处理组，不同浓度的ΝΕCA 处理组，对照组处理 24 小时后，WA）和 Q-PCR(B)分别检测 HLA-DRα蛋白和 mRNA 水平。然后转染 DR-a 报告再用ΙFΝ γ或者不同浓度的ΝΕCA 处理后，结果为与对照组相比相对的荧光值。3 个复孔，差异明显有统计学意义（ ，P <0.05）

在肺成纤维细胞中腺苷信号通路通过A2b受体抑制CIITA表达

图 3. 在肺成纤维细胞中腺苷信号通路通过 A2b 受体继而调控 CIITA 的表达。（A-D）IMR-90 分别用 IFN γ ，ΝΕCA 或者 MRS-1754 处理 24 小时后，用 ChIP 的方法检测染色质结合能力。共沉淀的 DNA 分别用 CIITA 两个亚型 III（A,B）或者 IV(C,D)启动子区域引物扩增。每组实验均重复3次，差异明显有统计学意义（ ，P<0.05）
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本文编号：2844698