白纹伊蚊卵滞育与登革Ⅱ型病毒传播关系的研究

发布时间：2020-10-20 08:18

　　 登革热(Dengue fever，DF)／登革出血热(Dengue haemorrhagic fever，DHF)是重要的虫媒病毒病之一，其病原体登革病毒为黄病毒属(Flavivirus)具包膜的单股正链RNA病毒，主要由埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Ae．albopictus)传播，广泛流行于全球热带和亚热带地区。诸多的实验室和野外实验均已证实在自然界存在着白纹伊蚊经卵传递登革病毒的现象，而滞育卵是白纹伊蚊实现远距离扩散的主要途径之一。登革病毒能否在感染白纹伊蚊滞育卵内存活，并随着滞育卵通过交通运输、旧轮胎贸易等人类活动扩散到世界许多国家和地区?是一个值得关注的问题，目前尚未见研究报道。 本研究以白纹伊蚊广州株为研究对象，经口感染大剂量登革Ⅱ型病毒(Dengue 2 virus，DEN-2)后，收集3个生殖营养周环产的卵，一部分在实验室条件下模拟冬季相对低温、短光照及干燥的自然环境条件(4℃、75％RH、L／D=8／16)，诱导滞育；另一部分采用实验室常规保存条件，在常温条件下给以干燥处理(25℃、75％RH、L／D=14／10)。首先利用半套式PCR、C6／36细胞培养分离病毒等方法检测和分离卵内病毒；进一步用核酸杂交的方法监测卵内病毒RNA的合成，以期确证登革Ⅱ型病毒能否在白纹伊蚊滞育卵内存活并有可能增殖，探讨滞育卵代谢活动的减弱与病毒转录、复制间的相互协调机制；并通过滞育卵解除滞育后F_1代蚊虫感染率检测，以及叮咬敏感乳鼠的传播实验，明确登革Ⅱ型病毒能否经滞育卵传递至子代并能进一步水平传播；进而了解垂直传递病毒是否影响滞育卵的孵化及F_1代蚊虫的生殖能力，来探讨自然界蚊媒体内病毒的保存机制以及媒介—病毒—宿主三者之间的相互关系。本研究获得以下几个方面的结果： 1 感染白纹伊蚊滞育卵内病毒的检测和分离 通过半套式PCR、C6／36细胞培养分离病毒等方法，多角度证实能在感染DEN-2白纹伊蚊滞育卵内检测和分离到病毒，同时常规保存条件下干燥处理的卵内也检测和分离到病毒。另外，研究发现接种C6／36细胞的感染白纹伊蚊常规干燥保存卵导致C6／36细胞病变的时间较滞育卵早12小时左右。 2 卵内登革病毒的存在状态 利用地高辛标记的不对称PCR扩增产物制备单链探针(正链和负链探针)，进行核酸杂交来监测卵内登革病毒复制动态。Southern杂交方法在感染白纹伊蚊滞育卵和常规干燥保存的卵中均检测到病毒正股RNA和负股RNA，但滞育卵中病毒负股RNA杂交信号非常的弱，表明负股RNA含量极低；常规干燥保存的卵内无论正股RNA还 of 是负股RNA，都有较强杂交信号。正股RNA和负股RNA的成功检测，表明滞育卵 和常规干燥保存卵均感染病毒，即用S。＂them杂交的方法也能够在感染白纹伊蚊滞育 卵和常规干燥保存的卵中均检测到病毒；采用 L汇1沉淀的方法将复制中间型（RI） RN A和复制型（RF）RN A分开后，正链探针用于检测复制中间型RN A，负链探针 用于确认复制型RNA的合成。斑点杂交结果发现常规干燥保存卵中，RI RNA和 RF RNA均有杂交信号，说明病毒仍然进行着循环复制；滞育卵中检测不到RI RNA和 RF RNA的合成，而Southern杂交检测到极少量的负股RNA，表明在滞育卵中病毒 复制的相对静止发生在从负股 RNA到 RF RNA这一步。 3感染白纹伊蚊不同生殖营养周期F；代蚊虫感染率差异 采用半套式PCR、C6八6细胞培养分离病毒等方法检测FI代蚊虫感染率，第一个 生殖营养周期滞育卵和常规干燥保存卵内均没有检测和分离到病毒，这与病毒在经口 感染的蚊虫体内增殖的时间有关；此外，对第二、三生殖营养周期产卵孵化的于代蚊 虫感染率检测结果经统计学检验，结果显示第二、三生殖营养周期FI代蚊虫感染率 没有显著性差异…＞0刀5人 旱感染白纹伊蚊卵的滞育与常规干燥保存对子代感染率的影响 采用半套式PCR、C6／36细胞培养分离病毒等方法检测滞育卵和常规干燥保存卵 孵化的h代蚊虫感染率，半套式PCR检测结果表明常规干燥保存卵孵化的F；代蚊虫 感染DEN－2的批阳性率为 18．8O，子代最低感染率为 1：160（0．63O），明显高于滞 育卵孵化的 FI代蚊虫感染率（批阳性率为 9石％，于代最低感染率为 1：294二 ＊．34％厂，／检验的统计结果显示经滞育卵和常规干燥保存卵孵化的子代蚊虫感染 率有显著性差异（Xz－2．47，p＜0．05人结果表明登革＊型病毒能够经感染白纹伊蚊滞 育卵和常规干燥保存卵传递至于代。 5感染白纹伊蚊滞育卵孵化的h代成蚊叮咬乳鼠水平传播登革病毒 低氧水刺激感染白纹伊蚊滞育卵孵化后，羽化5天的F；代雌蚊刺叮1 日龄健康 乳鼠，传播阳性率为 6．l％，结果表明登革＊型病毒能经滞育卵传递至子代并能通过 叮咬敏感宿主水平传播。 6＄染病毒对白纹伊蚊滞育卵的孵化及FI代成蚊产卵量的影响 用低氧水刺激滞育卵解除滞育后，收集按时间顺序孵化的7批幼虫，半套式PCR 检测其阳性率，发现最早孵化的一批幼虫最低感染率为 1：15（6石7％），第二批孵化 的幼虫最低感染率为 1：75（0．13％），而在此之后
【学位单位】：西南农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R38
【部分图文】：

为病毒基因组RNA，对RNA酶敏感。子代基因组的正链RNA是通过RNA的RI和RFRNA的形式合成的，然后子代RNA又呈现mRNA的作用，从而产生更多的病毒蛋白，同时又作为模板，产生更多的中间体，形成子代RNA(图1.1)(殷震，刘景华，1997)。登革病毒的装配过程涉及到病毒各结构成分之间极其复杂的分子间的相互作用。DEN病毒的核衣壳由衣壳蛋白C及基因组RNA构成，其中C蛋白含大量的Lys和Arg残基，这些碱性氨基酸可部分中和RNA的负电荷。目前病毒衣壳蛋白如何与子代RNA形成病毒核衣壳，以及对C蛋白具有的核定位位点重要性极其与病毒形态发生的关系尚不清楚。初步认为登革病毒颗粒组装过程如下:在蛋白合成过程中E、PrM插入粗面内质网膜;C蛋白与病毒的RNA在胞浆中装配成核衣壳，并集中于内质网膜的细胞浆侧。核衣壳可能通过芽生方式获得包膜，非成熟病毒颗粒在内质网组装，然后进一步转运到反式高尔基体

低温、短光照诱导的滞育时间为4周、6周的感染白纹伊蚊滞育卵及常规干燥保存6周的卵，应用黄病毒通用引物进行Rl飞PCR扩增后，以该扩增产物为模板，应用内引物的酶促扩增可得到与设计相符的189bp的目的基因片段(图3.2)。实验同时设置感染登革n型病毒C6/36细胞作为阳性对照，也扩增出189bP的目的片段，而非感染白纹伊蚊滞育卵和常规干燥保存的卵(阴性对照)采用该引物检测无特异性扩增条带出现。结果表明感染DEN一2病毒的白纹伊蚊滞育卵和常规干燥保存的卵中均能检测到病毒。65432IM2000bP1000bP750bP500bP250bP100bP图3.2感染OEN一2白纹伊蚊卵半套式PCR扩增产物M:DL2000DNAMarker(TaKaRa公司);l:感染oEN一2病毒的C6/36细胞;2:白纹伊蚊常规干燥保存卵;3:白纹伊蚊滞育4周的卵;4:白纹伊蚊滞育6周的卵;5:非感染常规干燥保存卵;6:非感染滞育卵

M:oLZ000洲^Marker(T妞KaRa公司)，1:DEN一2infeCtedc6/36cell，2:Normalpreservedofeggs，3:4一weeksdiaPausingeggs，4:6一weeksdiaPausingeggs，5:UninfeetednormalPreservedeggs，:UninfeeteddiaPausingeggs3.2.3C6136细胞培养分离病毒分别接种滞育卵和常规干燥保存卵研磨液的C6/36细胞，盲传一代后，细胞均出现典型病变(cytopathiceffect，CPE)，其中图3.3一A为接种感染白纹伊蚊滞育卵后发生病变的细胞;图3.4一A为接种感染白纹伊蚊常规干燥保存卵后发生病变的细胞。可以看出病毒感染的细胞形态发生变化，细胞出现堆集甚至融合、破溃等现象。同时研究发现接种常规干燥保存卵的C6/36细胞出现病变的时间较滞育卵早12小时左右，这可能与标本中病毒数量的多少或与病毒生长的速率有关(殷震，1997)，或者可能与病毒在这两种不同处理卵中存在状态有关。上述结果表明感染白纹伊蚊滞育卵和常规干燥保存的卵中均能够分离到病毒，该结果与半套式PCR检测结果一致，即在感染白纹伊蚊滞育卵和常规干燥保存的卵中均能够检测和分离到病毒。
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本文编号：2848443