人TALL-1基因的克

发布时间：2020-10-21 00:19

　　 人类基因组计划将基因组学推向了生物医学研究的最前沿。基因组学研究的进展又将由之产生的新的生物技术推向了世界经济的前沿。在这个时代，基因组药物具有巨大的开发潜力。迄今为止至少有19个肿瘤坏死因子(TNF)超家族和29个肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员被发现，它们作为机体内产生的一类重要的细胞因子，在细胞增殖、分化、凋亡以及免疫反应、炎症等一系列生理和病理反应过程中均具有非常重要的调控作用。 TALL-1(TNF and apoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 1)又名BlyS、THANK、BAFF、zTNF4和TNFSF20，是1999年首次克隆成功的属于TNFSF一个新成员，在外周血单核细胞、淋巴结、脾脏和骨髓等组织中表达最丰富。人TALL-1基因全长编码285个氨基酸，是一个典型的Ⅱ型穿膜蛋白，其中部分胞外区片段(A134～L285)在某些蛋白酶的作用下发生水解，可形成可溶性功能片段(sTALL-1)。与TNF家族其它成员相比，TALL-1胞外区与APRIL有高度的同源性，而与其它家族成员如TNF、FasL、LT、TRAIL、LTα、LIGHT及RANKL等的同源性则小于20％。目前证实B细胞成熟蛋白(B cell maturation protein,BCMA)、跨膜激活与CAML作用因子(transmembraneactivator and CAML-interactor,TACI)和B细胞激活因子受体(BAFF-R)是TALL-1的受体。TALL-l是一个多功能多效应分子，具有强大的免疫调控功能，首先作为B淋巴细胞生长的强共刺激因子，TALL-1广泛参与调节B细胞的发育和分化以及抗体的产生；而且还广泛参与T细胞的活化和应答过程；其次TALL-1还具有TNF超家族成员的共性，对多种肿瘤细胞具有细胞毒效应。TALL-1除了在生理条件下参与调节免疫反应以外，还与多种疾病的发生和发展密切相关，在转基因动物试验中人们发现TALL-1在狼疮样等自身免疫性疾病形成中很可能具有重要的调控功能，其过量表达可明显提高机体的成熟B细胞及外周CD4+和CD8+T细胞的数目，从而诱发一系列自身免疫性疾病。 鉴于TALL-1的重要作用，自发现以来很快成为生命科学研究的热点之一。为了探讨TALL-1的生物学性能及用于自身免疫性疾病和肿瘤治疗的免疫调节的可能性，以及深入的研究结构与功能的关系，开发新型基因组药物打下基础，本研究首先通过生物信 第三军医大学博士学位论文 息学分析设计合成引物，采用RT一PCR技术从人新鲜淋巴结组织中获得编码TALL一l基 因全长及其可溶性部分的基因编码区cDNA;随后构建了携带TALL一1基因全长及其可 溶性部分基因编码区cDNA的毕赤酵母分泌型表达质粒和原核表达质粒，在此基础上筛 选获得含多拷贝基因的高表达株进行诱导表达，亲和层析纯化获得了重组sTALL一1蛋 白;在细胞水平及分子水平初步进行sTALL一1的功能研究，观察sTALL一1刺激B淋巴 细胞增殖活性及对纯化人外周T淋巴细胞的共刺激效应，初步研究sTALL一1蛋白对肿 瘤细胞的细胞毒效应及其机理;最后利用己知的晶体结构信息和生物信息学分析对 sTALL一1结构进行了缺失突变，得到了两个突变体，并对它们进行了诱导表达和初步鉴 定。研究的主要实验方法及结果如下: 1、通过生物信息学分析设计合成引物，采用RT一PCR技术从人新鲜淋巴结组织中 克隆获得编码TALL一1基因全长及其可溶性部分的基因编码区cDNA，将其克隆入有。 因子分泌信号肤的毕赤酵母分泌型表达载体pPIC一gK中，并进行了序列测定。 2、将表达载体采用单交换的整合方式电转化毕赤酵母菌株GS 1 15(Mut+)，筛选高 拷贝重组转化子，通过对甲醇诱导表达条件的优化，表达量有所提高但仍然不够理想， SDS一PAGE分析未见明显的目的蛋白条带，分泌上清中总蛋白含量测定在d4一d5达到高 峰，采用RT~PCR和3’RACE方法从转录水平检测到转化子中目的基因的转录，W七stem blot和EUSA检测结果显示，浓缩后的表达上清中确实含有目的蛋白，上述结果证实了 目的基因在P.pastoris毕赤酵母真核表达系统中分泌表达的可行性，并且表达产物具有 免疫反应活性和抗原性，同时由于采用的是具有中和活性的单抗，二者发生反应一定程 度上说明分泌上清中的目的蛋白具有hTALL一1的生物活性，在此基础上利用MTT方法 检测到分泌上清的浓缩冻干产物对Hela细胞的生长有抑制效应，进一步证实分泌上清 中的目的蛋白具有hTALL一1的生物学活性。 3、将目的基因亚克隆到pGEx一4T一1质粒，测序证实后转染BLZI大肠杆菌，筛选 获得含多拷贝基因的高表达株，以护TG诱导其高效表达，优化表达条件，初步探索 sTALL一1基因工程表达的条件，建立sTALL一1原核表达基因工程菌株，并用祸联有谷胧 甘肤的GsTrap亲和层析纯化，凝血酶柱上切割获得sTALL一1蛋白，SDS一 PAGE和Westem blot检测纯化蛋白。 4、在细胞和分子水平初步进行sTALL一1的功能研究，结果表明表达蛋白sTALL一l 与抗IgM共同刺激B淋巴细胞，可使B淋巴细胞达到不同程度的增殖:在抗CD3单抗 第三军医大学博士学位论文 作用的基础上，加用表达蛋白sTALL一1可明显增强抗CD3单抗对T淋巴细胞的刺激作 用;应用MTTt匕色法发现，表达产物sTALL一l蛋白对A549、Hela、H446和U937细 胞具有明显的生长抑制效应，凋亡率从41.4%勺2.5%
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R346
【部分图文】：

明所提取的RNA纯度较高，符合实验要求。甲醛琼脂糖变性电泳结果显示:具有285、185和5s三条带，且285:185大约为2:1，确定RNA的完整性较好，没有发生降解，所得RNA符合RT.PCR模板要求(图3)。Fig3AgaroseeleetrOPhoresisanalysisoftotalRNA

取纯度和完整性均较好的总RNA为模板，经反转录及高保真Taq酶PCR扩增后，取扩增产物spl电泳，可以观察到特异性扩增带，位置分别相当于858bp和459bp，与预期的大小完全一致(见图4)。图4基因片段的RT一CR结果Flg4Rl，一PCRresultsofgenesegments3.酵母表达载体pP1CgK一hTALL一1和pP1CgK一sTALL一1的构建和鉴定3.1PCR鉴定和酶切鉴定扩增产物经纯化回收后，在T4DNA连接酶作用下，与pPIcgK载体连接构建重组子，对连接产物进行PCR鉴定、酶切鉴定，鉴定结果进行1.5%琼脂糖凝胶电泳(图5，6)，结果表明目的基因重组到表达载体上，分别命名为pPIcgK一hTALL一1和PpICgK一sTALL一l。3.2DNA序列分析登陆http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAsT/采用Aligntwosequences(blZseq)与公布的TALL一IcDNA序列(GenBank登录号AF1326OO)同源性比对分析

图5pplcgK一hTALL.l和ppICgK一sTALL一1重组载体的酶切鉴定Fig5RestrietionenzyrnedigestionanalysisofPPICgK一hTALL~】andPPICgK一sTALL一lM12Marker:DL2000(20创刃100叨750/500/250/100bP):STALL一12:hTALL.1
【参考文献】

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本文编号：2849358