自噬与凋亡在柯萨奇病毒B组3型感染细胞过程中的变现及相互作用的机制研究

发布时间：2020-10-22 08:31

　　 自噬和凋亡在病毒感染中起着关键作用,一方面可以通过降解病毒,递呈病毒抗原,激活机体免疫反应,从而达到清除病毒的目的；另一方面,病毒也可利用对自噬和凋亡的调控逃逸机体的抗病毒作用,维持自身的存活和复制。病毒感染细胞后可以引起细胞死亡,但同时病毒又必须借助活的细胞完成自身的复制过程,而正常状态下,自噬利于细胞存活,凋亡却是细胞的死亡方式,因此自噬和凋亡之间的平衡对病毒的复制周期影响重大。研究表明,柯萨奇病毒3型(Coxsackie virus,CVB3)可以诱导细胞发生自噬,也可以诱导细胞发生凋亡。但目前,CVB3诱导自噬的具体发生机制不详,凋亡发生的依赖途径研究结果不一致；自噬和凋亡之间的相互调控机制、CVB3对自噬和凋亡关系的影响以及自噬的凋亡的关系对CVB3复制周期的影响目前也都不明确。因此,本文通过体外实验,围绕上述问题展开研究,以深入了解CVB3与细胞间的直接相互作用。 在本试验中,我们首先证实了自噬体在CVB3感染过程中的表现及调控机制。实验结果提示,CVB3感染HeLa细胞后,自噬体增多；而予巴洛弗霉素抑制自噬体和溶酶体的结合后,自噬体进一步增多,说明在CVB3感染过程中,自噬途径仍能发挥降解功能,自噬体累积的原因在于自噬体的生成增多。为进一步探求CVB3诱导自噬体生成增多的机制,我们检测了细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated Protein kinases, ERK)的激活状态,即磷酸化-ERK(p-ERK)的表达,结果显示,p-ERK在CVB3感染后表达增多,说明ERK蛋白被激活；而予U0126(有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)抑制剂)处理HeLa细胞后,ERK的激活水平及与自噬体数量均减少,说明HeLa细胞感染CVB3后,ERK的激活与自噬体的增多有关。 接下来,ERK激活的机制被进一步探索。首先,我们检测了AMPK/MEK/ERK通路的活性状态：结果显示,CVB3感染后AMP相关的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)、MAPK/ERK激酶(MAPK/ERK kinase,MEK)均被激活,并且磷酸化-AMPK(p-AMPK)和磷酸化-MEK(p-MEK)间的相互作用增强,而以compoundC(AMPK激酶抑制剂)处理HeLa细胞后,MEK、ERK活性水平下降,提示ERK可以通过AMPK/MEK/ERK通路被激活：而通过进一步的检测,我们发现CVB3感染的HeLa细胞胞质内游离钙离子浓度升高、三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate, ATP)含量及线粒体膜势能降低,上述结果提示,AMPK/MEK/ERK通路的激活可能在于,CVB3感染造成细胞膜通透性增高,从而使细胞质内游离钙离子浓度升高,损伤线粒体,ATP含量降低,激活AMPK蛋白,进而激活整个通路;其次,我们检测了另一条ERK的激活通路即Ras/Raf/MEK/ERK通路的活化状态：结果显示,CVB3感染后,磷酸化-Raf1(p-Raf)蛋白和磷酸化-MEK(p-MEK)蛋白表达均增加,说明Ras、Raf1蛋白均被活化；进一步检测MEK是否可以通过该途径被激活,结果显示Raf1蛋白和p-MEK蛋白结合增加,而以GW5074(Raf激酶抑制剂)抑制Raf1蛋白的活性,MEK、ERK蛋白的激活也受到抑制,证实MEK、ERK蛋白也可以通过Ras/Raf/MEK/ERK通路被激活；为进一步探索CVB3与Ras/Raf/MEK/ERK通路活化的关系,我们检测了RasGAP蛋白的表达,结果发现,RasGAP蛋白于9h.p.i.被裂解,说明CVB3感染后可能通过裂解RasGAP蛋白,使Ras蛋白被活化,进而整个Ras/Raf/MEK/ERK通路被活化。 然而,虽然两条通路在12h.p.i.后均仍处于较高的激活水平,但是,自噬体数量却开始减少,因此,从CVB3感染后12h起,可能出现了抑制自噬体生成的因素。为验证该假设,首先我们检测了自噬相关蛋白(Autophagy-related gene,Atg)-5和beclin-1蛋白的变化,结果发现,二者在9h.p.i.均被裂解；而进一步检测多种含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase),包括Capase3、8、9等,结果发现,从CVB3感染9h起,这些Caspase蛋白均有不同程度的激活,与Atg5、beclin-1被裂解的时间点一致,因此,为进一步探索Caspase蛋白的激活与Atg5、beclin1蛋白裂解间的关系,我们予多种Caspase抑制剂(Z-VAD-FMK、Z-LEHD-FMK、Z-IETD-FMK)抑制Caspase舌性后,Atg5、beclin-1蛋白的裂解条带均明显减少或消失,自噬水平明显增高；同时,抑制caspase后,凋亡水平明显下降。这些结果提示,CVB3感染导致的凋亡依赖于caspase途径,激活的caspase裂解了Atg5和beclin-1蛋白,从而抑制了自噬水平,却促进了凋亡的发生。 为了进一步明确Caspase裂解自噬相关蛋白Atg5和beclin-1蛋白的原因,即凋亡的发生是否依赖于自噬的抑制,我们通过实验观察了自噬对凋亡的作用。结果发现,自噬对凋亡的作用较复杂。以自噬抑制剂(3-MA)或自噬诱导剂(雷帕霉素,Rapamycin)分别处理细胞后,常规感染CVB3,并于18h.p.i.收取细胞,结果发现自噬体数量及凋亡水平均相应的减少或增加；而予3-MA后,3h.p.i.收取的细胞凋亡水平降低,但予Rapamycin处理组,细胞的凋亡水平无明显变化。18h.p.i时自噬和凋亡之间呈现正相关性变化,其原因可能在于不同的处理对病毒量的影响。为进一步证实该假设,CVB3按不同的MOI感染HeLa细胞,检测凋亡水平及细胞内CVB3mRNA的表达,结果提示病毒量的变化可以直接引起凋亡水平的变化。而检测感染后不同时间点HeLa细胞中CVB3含量的变化,结果发现,3h.p.i.病毒量较低,因此,病毒量本身的变化可能对凋亡的影响不大,此时干扰自噬体形成,可以了解自噬对凋亡的真正影响,即自噬抑制凋亡。 接下来,本实验中进一步探索了自噬抑制凋亡的机制。我们分别予p62siRNA或p62质粒转染细胞,使p62蛋白相对的减少或增加,结果发现,Caspase-8活性相应增强或降低,但Caspase-3、9的活性变化与p62蛋白的变化并不一致。而予巴弗洛霉素处理细胞后,无论予p62siRNA或p62质粒,Caspase3、8、9的活性均无明显变化,因此,自噬抑制凋亡的机制在于p62蛋白介导的自噬途径对活化的Caspase-8的降解。而检测p62蛋白在感染后各时间点的变化,发现该蛋白在9h.p.i.表达减少,结合以往研究结果,我们认为是CVB3直接造成了该蛋白的裂解,从而减少了自噬途径对活化的Caspase-8的降解,促使细胞从自噬转变为凋亡。然而,通过分析Atg5及beclin-1蛋白的检测,结果发现,二者的蛋白总量均有所增高,而且mRNA水平在CVB3感染后也均有增高,因此自噬的发生存在转录水平的调控,从而避免细胞过早的发生凋亡。 自噬和凋亡间的复杂关系对CVB3生活周期的影响如何?本实验中进行了进一步的验证。分别予自噬抑制剂(3-MA)、自噬诱导剂(Rapamycin)、凋亡拟制剂(Z-VAD-FMK、Z-LEHD-FMK、Z-IETD)处理细胞后,检测细胞内及上清中CVB3含量,结果发现,予自噬抑制剂或诱导剂后,细胞内及上清中的CVB3含量分别下降或上升；予凋亡抑制剂后,在低剂量时,细胞内CVB3mRNA的含量略升高,而上清中病毒含量下降；加大剂量后细胞内及上清中病毒的含量进一步减少。结合以往的研究,我们认为自噬利于CVB3的复制而非释放,而凋亡利于CVB3的释放而非复制。 综上所述,我们认为CVB3可以通过各种机制影响被感染细胞的自噬和凋亡过程,并利用自噬向凋亡的转换完成自身的复制,具体表现为：CVB3感染后,一方面,可以通过直接裂解RasGAP蛋白,从而激活Ras/Raf/MEK途径；另一方面引起了胞膜通透性的改变,使细胞胞质内游离钙离子浓度增高,线粒体被损伤,ATP减少,从而激活AMPK/MEK途径。上述两条途径的激活都可以导致ERK的活化,后者的活化可以导致自噬体累积。CVB3利用自噬体进行复制。与此同时,自噬体通过p62介导活化的Caspase-8的降解,从而抑制凋亡,保证CVB3有充足的时间进行复制。到复制中后期,如感染后9h开始,CVB32A和3B蛋白组装完成,可以裂解p62蛋白,解除自噬对活化的Caspase-8的降解,活化的Caspase-8逐渐积累,与Caspase-9途径上的凋亡蛋白共同裂解自噬相关蛋白Atg5、beclin-1,抑制自噬体的产生,从而使活化的Caspase-8进一步累积,自噬逐渐向凋亡转换,但在此过程中Atg5及beclin-1存在mRNA水平的调控,控制凋亡发生的速度,从而使CVB3在充分复制后得以释放。上述机制的阐明,有助于我们更好的了解CVB3的复制周期与细胞间的相互作用,从而为防治CVB3感染开拓思路。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R363
【部分图文】：

一.CVB3感染后自_；的表现及诱导机制1. CVB3感染后自趣体数量增多为观察CVB3感染对自唾体数量的影响，我们釆用Western blot方法检测了 CVB3感染的HeLa细胞中LC3蛋白的表达，结果显示（图1-1 A)，CVB3感染后3h，LC3II蛋白表达即幵始增多，9 h达到峰值后，从12h开始减少，24h时再次降低，说明自唾体的数量先增多后减少；而LC3I蛋白从感染后6h开始减少，9 h达到最低值后，从12h开始增多，24h时进一步增多，结果说明自嗟体的生成先增多后减少。为进一步证实在CVB3感染过程中确有自卩蜜体增多现象，我们用免疫焚光的方法再一次检测了 LC3蛋白的表达，从图1-1可以看出（其中绿色代表LC3蛋白，蓝色代表细胞核），9h.p. LLC3荧光点明显聚集成团块状，而对照组呈散点状分布，说明在感染CVB3的细胞中确实有自暖体增多的现象；接下来，我们通过予巴洛弗霉素处理细胞以进一步了解在CVB3感染过程中自噬体增多的原因，结果（图1-1C)显示，予巴洛弗霉素抑制自噬体和溶酶体的结合后，LC3II蛋白及自嚼途径特异性降解蛋白p62蛋白表达均升高，该结果表明：自唾途径的降解功能仍存在，因此，CVB3感染导致的自喫体增多的主要原因在于自哩体的生成增多。A.

图1-1 A. CVB3以M01=10感染HeLa细胞，于感染后不同时间点收取细胞。Westblot法检测LC3蛋白的表达；B. CVB3感染后9h, LC3蛋白的荧光检测（绿色LC3蛋白，蓝色代表细胞核，X100倍）；C.予bafilomycin lOOrai处理细胞IhCVB3按M01=10常规感染细胞，18h. p. i.收取细胞，Western blot法检测LC3及蛋白。* P〈0.05组间相比。A组实验重复6次；B和C组实验至少重复3次。2自唾体的增多与ERK的激活有关为探索CVB3感染过程中自噬体增多的机制，首先，我们检测了 ERK的活即憐酸化-ERK (P-ERK)的表达。Western blot结果显示，ERK总蛋白量各时间点均无明显改变，而从6h.p. i.开始，ERK总蛋白中磷酸化状态的E表达升高，12h、18 h维持在峰值，24h略有减少（图1-2A),说明从感染始ERK蛋白即被激活，并且一直处于较高水平的活性状态。随后，我们采激酶抑制剂U0126处理细胞以观察ERK活性状态对自唾的影响，结果显示，蛋白的表达量无明显改变，但P-ERK蛋白表达明显受抑制；LC3I蛋白增多，36

各时间点均无明显改变，而从6h.p. i.开始，ERK总蛋白中磷酸化状态的ERK蛋白表达升高，12h、18 h维持在峰值，24h略有减少（图1-2A),说明从感染后6h幵始ERK蛋白即被激活，并且一直处于较高水平的活性状态。随后，我们采用MAPK激酶抑制剂U0126处理细胞以观察ERK活性状态对自唾的影响，结果显示，ERK总蛋白的表达量无明显改变，但P-ERK蛋白表达明显受抑制；LC3I蛋白增多，而LC3n36

本文编号：2851357