逆转录病毒介导人胰岛素原突变基因转染肝细胞分泌成熟胰岛素的实验研究

发布时间：2020-10-22 08:09

　　 第一部分 人胰岛素原基因的定点突变和修饰 目的：完成人胰岛素原基因5个碱基的定点突变，并加上信号肽和增强表达的Kozak序列，使之能在普通细胞中被Furin蛋白酶识别，从而去除C肽，分泌成熟胰岛素。 方法：采用PCR体外定点突变技术（PCR-SDM），设计4对引物，引入5个Furin蛋白酶识别的突变位点，通过重叠延伸法PCR扩增，使人胰岛素原编码基因B10密码子由CAC突变为GAC；C3密码子由GAA突变为AAA；C4密码子由GCT突变为CGT；C32密码子由CTT突变为CGT，并在其上游加上信号肽和Kozak序列，将扩增片段克隆入T载体并测序。 结果：DNA测序结果表明预期位点突变符合要求，信号肽和Kozak序列正确引入。 结论：应用PCR诱导突变技术，在体外能准确、简便有效诱导 国家自然科学基金资助(No.30070356) WP=10 胰岛素原基因突变，使体外应用非内分泌细胞构建高效分泌成熟胰岛素细胞克隆成为可能。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R346
【部分图文】：

图 1-1 pHIL-D2 的物理图谱Figure1-1 Map of pHIL-D2Amp+）质粒：是一种高效克隆 PCR 产物（TA Cloni 载体改建而成的，即在 pUC18 载体的多克隆位点之间插入了 EcoRⅤ识别位点，用 EcoRⅤ进行酶切加“T”而成，它具有 pUC18 载体完全相同的功能酶反应时都有在 PCR 产物的 3’末端添加一个“A可以大大提高 PCR 产物的连接、克隆效率（图 1-2）

图 1-2 pMD18-T 的物理图谱Figure1-2 Map of pMD18-T菌种：oli DH5α及 E.coli JM109 菌株由第三军医大学野战外科研究所分子生验室保存，杨登科博士惠赠。主要仪器和器皿sTM and Milli-QTM 水纯化系统（Millipore，美国）antiTM J-30I 型低温超速离心机（BECKMAN，美国）Q-X100 恒温振荡培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司，中国)-7500 紫外分光光度计(BECKMAN，美国)

Figure1-3：PCR pattern for human proinsulin reconstruction图 1-3：用于改造胰岛素原的 PCR 模式图（1）第一轮 PCR 反应：以 PHIL-D2-hPINS 质粒为模板，分别以 F02/R03，F03/R02，F04/R01 为引物进行 PCR 扩增。反应体系：10×Pyrobest Buffer 5 μl模板 DNA 1 μl上游引物 1 μl下游引物 1 μldNTP Mixture (2.5mM each) 4 μlPyrobest DNA Polymerase 1 μl
【相似文献】

相关博士学位论文 前10条

1 兰丽珍;逆转录病毒介导人胰岛素原突变基因转染肝细胞分泌成熟胰岛素的实验研究[D];重庆医科大学;2004年

2 杨东山;转基因克隆法制作人胰岛素原牛乳腺生物反应器的研究[D];内蒙古大学;2005年

3 汪春义;人参愈伤组织源性细胞系表达人胰岛素的研究[D];吉林大学;2007年

4 萧新华;糖尿病基因治疗的实验研究[D];中国协和医科大学;1997年

5 林新;1. A链链内二硫键错接（A11Ser，A12Cys）胰岛素突变体的构建、表达及其活性分析 2. 淫羊藿化合物抗肿瘤活性筛选和小檗胺免疫抑制作用的研究[D];中国协和医科大学;1998年

6 谭翠燕;蛋白质折叠/解折叠研究[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2007年

7 高剑坤;一种新型长效人胰岛素类似物的研制[D];重庆大学;2007年

8 乔志松;胰岛素受体配基结合结构域L1和L2的表达与鉴定及胰岛素原的折叠与解折叠[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2002年

9 盛卫忠;Ⅰ型糖尿病的基因治疗研究[D];复旦大学;2004年

10 王小清;脂肪组织分泌炎症介质及作用机制研究[D];中南大学;2003年

相关硕士学位论文 前10条

1 周国强;黄瓜表达霍乱毒素B亚基—人胰岛素原融合蛋白的研究[D];吉林大学;2010年

2 胡兵;hGH，HSA-双精氨酸C肽人胰岛素原的表达、加工及重组胰岛素的降糖活性分析[D];海南大学;2010年

3 张冉;利用油菜油体系统表达重组人胰岛素原的研究[D];上海师范大学;2010年

4 冯亚杰;山羊BLG调控序列及CMV增强子指导人胰岛素原基因在细胞和小鼠中表达[D];扬州大学;2007年

5 王倩;人胰岛素突变体的分子设计与克隆[D];兰州理工大学;2011年

6 雍彬;重组人胰岛素原在大肠杆菌中的可溶性表达及分离纯化研究[D];四川师范大学;2007年

7 张巍;用拟南芥表达重组人胰岛素原研究[D];东北林业大学;2010年

8 冷雪;快速型重组人胰岛素及C肽的研究[D];北京化工大学;2006年

9 董鹏;重组人胰岛素原在毕赤酵母中的表达及分离纯化的研究[D];北京化工大学;2006年

10 陈阳;重组人胰岛素在大肠杆菌中表达及分离纯化[D];北京化工大学;2008年

本文编号：2851337