人血管内皮生长因子及其受体Flt-1功能域在巴氏毕赤酵母中的表达和生物学活性的研究

发布时间：2020-10-25 22:19

　　 血管内皮生长因子（vascular endothelium growth factor，VEGF）是血管内皮细 胞的特异丝裂原，具有促进血管内皮细胞增殖，加速新血管形成的作用。VEGF是通 过与血管内皮细胞表面的特异性受体结合而发挥其生物学效应的，在胚胎发育和心 血管、肿瘤等疾病的发病和防治中具有重要作用。本文着重从以下三个方面对VEGF 及其受体Flt-1进行了研究。 一、人血管内皮生长因子VEGF_(165)在Pichia.pastoris中的表达、纯化及其生物学活 性检测 利用PCR技术，从phVEGF_(165)·SR真核表达质粒扩增出hVEGF_(165) cDNA，构建酵母 分泌型表达质粒pPIC9K/hVEGF_(165)，分别用单交换和双交换的方法将目的基因整合到 两种宿主菌GS115和KM71的染色体上。鉴定转化子表型（His~+Mut~s和His~+Mut~+），G418 加压筛选多拷贝整合菌株，经甲醇诱导在Pichia.pastoris酵母中实现了hVEGF_(165)的 高效分泌性表达，SDS-PAGE显示其表达量占上清中蛋白总量的60％左右，蛋白质定 量分析示其产量约为0.3g/L。ELISA和Western blot表明，表达产物具有hVEGF_(165) 抗原性。 表达产物经Hepsrin-sepharose CL6B亲和层析纯化后，纯度可达90％以上。 分别采用HUVEC细胞株MTT比色法及~3H-TdR掺入法对重组hvEGF_(165)的生物学活 性进行了测定，两种方法结果完全一致，证实表达产物能特异性刺激HUVEC的增殖， 具有天然VEGF的生物学活性。 二、利用酵母双杂交系统研究人血管内皮生长因子受体Flt-1的配体结合域 利用RT-PCR技术，从HUVEC中扩增出四个截短的Flt-1 cDNA，分别含胞外第 2，1-2，2-3和1-3个loop。构建融合表达质粒pGBT9/hVEGF_(165)和pGAD424/Flt-1（2）、 pGAD424/Flt-1（1-2）、pGAD424/Flt-1（2-3）、pGAD424/Flt-1（1-3），并将pGBT9/类 质粒与pGAD424/类质粒两两配对转化酵母菌SFY526，采用滤纸法和液体培养法对阳 性克隆进行β-半乳糖苷酶活性分析，结果显示，Flt-1（1-3）/hVEGF_(165)转化子2h显 蓝色，平均活性为65.2IU；Flt-1（2-3）/hVEGF_(165)转化子4h显色，平均活性为50.8IU； Flt-1（1-2）/hVEGF_(165)转化子10h显色，平均活性为17.5IU；而Flt-1（2）/hVEGF_(165)转 0 第一军医大学九七届博士学位论文（国家“‘863”计划资助课题） 化子即使 30h以上也没有颜色反应。说明不仅 13lOOp能与 VEGF结合，比其更小的 ］片段2－3100p也具有与其配体结合的能力，且结合能力与 1－310Op斥较接近，1－21。＊ 】的结合力较弱，单独第2个1刚叩无配体结合能力。 I 三、FIt－1胞外1－3和2－3looP在PJCbi。P。storjs中的表达、纯化及其生物学活 0 性检测 0 构建酵母分泌型表达质粒 PPICgK／Fit＊（13）和 PPICgK／Fit一1（2一3），利用 OPIChia．pasto厂is 酵母表达系统实现TFlt 一1（1一3）和Fit 一1（2一3）的高效分泌性表 l 达，SDS－PAGE显示其表达量占上清中总蛋白的60％以上，产量约为0．35g／L，ELIS＾ 及Western blot表明，表达产物具有良好的抗原性和特异性。 两种表达产物经 CM一sepharose fast fbwF 离子又换层析和 Sephacryl一100凝 D 胶过滤层析纯化后，纯度可这90％以上。 ］固相结合实验、固相竟争性结合实验、细胞竞争性结合实验、HUVEC细胞株 MTT ］t匕色法及屯呵dR掺入法等检测方法证实重组 Fit叶（1刁）和 Fit叶Q刁）都具有结合 IhVEGF；。。的能力和抑制 hVEGF；。。对 HUVEC 勺促增殖功能，其中前者的作用更为明显， I 但二者相差不大。 本文成功地利用PIChja．pssto汀s酵母表达系统，高效表达了hVEGF；。。，并证实J 其具有天然 VEGF的生物学活性，这对于开发其在缺血性。。脏病及肢体继发性动脉闭J 塞等疾病的防治开辟了广阔的前景。首次成功地利用酵母双杂交系统，高效筛选出－ Fit－1胞卜最J、g己体结合域一2－3looP，并在Pj奶ia．P。sic。is酵母表达系统中买现 了其高效分泌性表达，体外生物学活性实验证实其具有与VEGF结合的能力和抑制D VEGF对HUVEC的促增殖功能，这为进一步研究其在动物水平阻断VEGF的病理作用打 下了良好基础，为临床预防和治疗肿瘤、糖尿病性视网膜病变等血管生成相关疾病D 提供了新的手段。
【学位单位】：第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2000
【中图分类】：R392.11
【文章目录】：
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英文摘要
前言
165在Pichia．pastoris中的表达、纯化及其生物学活性检测'>第一部分 人血管内皮生长因子VEGF₁₆₅在Pichia．pastoris中的表达、纯化及其生物学活性检测
    材料方法
    结 果
    讨 论
    小 结
第二部分 利用酵母双杂交系统研究人血管内应生长因子受体Flt-1的配体结合域
    材料方法
    结 果
    讨 论
    小 结
第三部分 人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外1-3，2-3loop在Pichia．pastoris中的表达、纯化及其生物学活性检测
    材料方法
    结 果
    讨 论
    小 结
综述之一 甲基营养型酵母—Pichia．pastoris基因表达系统
综述之二 血管内皮生长因子及其受体的结构和功能
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1 张曼，周爱儒;血管内皮生长因子的功能与应用[J];生理科学进展;1996年03期

本文编号：2856038