应用Drug-western法从cDNA表达文库中筛选青蒿素类抗疟药靶标蛋白基因

发布时间：2020-10-26 14:29

　　 以总RNA中的mRNA构建的cDNA表达文库理论上含有该生物体的所有表达基因，可表达与天然蛋白相似的重组蛋白。建立cDNA表达文库在一次永久保存基因资源的同时，可以利用功能筛选、免疫学筛选、药物探针筛选、Southern杂交和大规模序列测定等现代分子生物学技术寻找特异性活性蛋白基因，进而克隆和表达这些基因，对从核酸及蛋白质等分子水平研究疟原虫的生命活动规律，对揭示其抗药性分子机理，搞清某些特效药物结合蛋白的基因及此类药物的作用机制，对新型抗疟药物的合理设计及筛选都具有极其重要的现实意义。 青蒿素是从传统中草药菊科植物黄花蒿中分离出的一种具有内过氧桥结构的倍半帖内酯。青蒿素类药物是一种与已知抗疟药如氯喹等完全不同的新型化合物。大量药理及临床研究证明青蒿素类药物是优于氯喹的抗疟新药，具有速效、低毒、高效等特点。1991年Meshnick等人提出了青蒿素类药物作用的二步机制假说：首先疟原虫体内血红蛋白的降解产物-亚铁血红素与青蒿素结合，激活青蒿素，催化内过氧桥裂解形成一个以碳原子为中心的自由基；然后自由基与亚铁血红素和虫体内一些特异性蛋白结合而起作用。青蒿素类药物可以选择性地烷化虫体内一些含量较低的蛋白，并且这种烷化作用依赖内过氧桥，但并不烷化未感染红细胞内的蛋白。虽然目前还没有直接证据表明虫体内蛋白质烷化是虫体致死的原因，但烷化蛋白与青蒿素类药物抗疟作用有关是很明显的。 Tanaka等建立了一种新奇、快速、方便的分离药物靶标蛋白基因的疗法：drug-western法。即利用标记分子与药物结合作为探针，直接从cDNA表达文库筛选药物结合蛋白的基因并分离和体外表达，以便获取目的蛋白进行结构和功能研究。与传统分离方法相比，其最大的优点是不需纯化而直接确认靶受体痕量蛋白基因。 翻译控制肿瘤蛋白最初在小鼠肿瘤细胞中被发现，是一个受翻译过程所阻遏并与肿瘤生长相关的蛋白质，随后在酵母及植物和除肾细胞外的各种动物组织正常细胞中被发现。从植物到动物的各类细胞中，TCTP都有广泛的高 度同源性和高度保守性，提示TCTP在细胞中有重要的生物学功能。虽然报道 认为TCTP具有钙结合、金属内环境稳定、细胞内信号传导、作为IgE依赖性 组胺释放因子等功能，但其具体生物学功能尚待进一步研究阐明。 Bhisutthibhan等把感染恶性疟原虫的红细胞与恤标记的双氢青篙素共培养， 发现几种特异性蛋白被标记，其中之一是TCTP。Walker于2000年在研究啮 齿类动物感染的约氏疟原虫对青篙素药物的抗性实验中发现，约氏疟原虫抗 性系中TCTP过表达，表达量是敏感系的2.5倍，据此，他们认为TCTP可能 是青篙素类药物靶标之一。 正是基于以上目的和研究背景，我们构建了恶性疟原虫海南株红内期 cDNA表达文库。把青篙素类衍生物:12B一二氢青篙素(4’一氧乙酸基)苯醚 用BsA标记作为探针，对恶性疟原虫海南株cDNA表达文库筛选，分离出插入 了恶性疟原虫海南株TCTP基因的阳性单克隆。对恶性疟原虫海南株TCTP基 因进行了克隆和表达，为进一步研究奠定了基础。 构建恶性疟原虫海南株红内期CDNA表达文库提取红内期恶性疟原虫 海南株总RNA，直接以总RNA为模板使用cDNA文库构建试剂盒，首先反转录 合成ss一DNA，再扩增合成ds一DNA(cDNA)，对扩增产物用蛋白酶K消化及左Z丁 I酶切，抽提蛋白、去除RNA后，用玻璃奶试剂盒纯化、回收20Obp以上的 片断，经与载体连接再用蛋白包装物包装后形成未扩增文库，最后扩增完成恶 性疟原虫海南株红内期cDNA表达文库的构建。所构建的cDNA表达文库滴度 为1.76x109，重组率达到90%。 Drug一乳stern法筛选恶性疟原虫海南株cDNA表达文库文库扩增后 使噬菌体噬斑转移到PVDF膜上，经漂洗后，用胶联剂EDC把青篙素类衍生物: 12乃一2氢青篙素(4’一氧乙酸基)苯醚与BSA连接作为探针与膜杂交，然后 依次与抗BSA抗体，辣根过氧化物酶标记的二抗共孵育，最后以增强化学发 光系统检测，使X光片感光。通过X光片上的感光斑点确定PVDF膜的相应位 置，再根据PvDF膜的相应位置找到培养皿上的对应噬菌体噬斑，挑取单噬斑 噬菌体扩增，经二次筛选除去假阳性，最终筛选出阳性单克隆噬菌体。对阳 性单克隆噬菌体人DNA纯化，经DNA测序并登陆美国GenBank国际基因库检 索，发现在一个阳性单克隆中插入了恶性疟原虫TCTP基因。 恶性疟原虫海南株TCTP基因的克隆及其在M15中的表达根据恶性 疟原虫海南株全长TCTP基因序列、pMD一踢一T克隆载体限制性酶切位点及 pQE一30表达载体限制性酶切位点设计引物，以含有TcTP基因的阳性单克隆 噬菌体入DNA为模板，扩增恶性疟原虫海南株全长‘lC’l’P基因，经与pMD一18一T 克隆载体重组，转化XLI一Blue。提取pMD一18一T质粒测序并登陆美国GenBank 国际基因库检索，所克隆的恶性疟原虫海南株fCTP基因与基因库中的恶性疟 原虫TCTP基因序列完全一致，提示己止确克隆了恶性疟原虫海南株TCTP基 因。对重组pMD一18一T克隆载体及pQE一30表达载体双酶切，提取TCTP基因和 pQE一30空载体并使二者重组，然后转化M15，挑取阳
【学位单位】：中国人民解放军军需大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2003
【中图分类】：Q781
【部分图文】：

oPCR产物经玻璃奶试剂盒
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本文编号：2857118