HBV-CpG诱导抗乙型肝炎病毒免疫应答

发布时间：2020-10-27 00:33

　　 慢性乙型肝炎病毒(HBV)是危害人类健康的难题之一,目前全球至少有3.6亿乙型肝炎病毒感染者,其中超过三分之一的人群在中国,这些人群面临着发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的高风险。由于慢性乙型肝炎患者对病毒产生不同程度的免疫耐受,以及HBV共价互补环状DNA(cccDNA)在肝内的持续存在,现有的抗病毒药物如干扰素(IFN)和拉米夫定等核苷类似物,只能一定程度抑制HBV的复制,最终达不到彻底清除HBV的效果,而且尚有一大部分慢性乙肝患者对上述抗病毒治疗无应答,因此发展更为有效的抗病毒药物是十分迫切。 通常情况下,病毒感染后会通过一系列机制激活免疫系统从而被清除,特别是病毒感染早期诱导表达Ⅰ型干扰素(IFN-α/IFN-p),I型干扰素不仅能诱导大量的抗病毒蛋白,而且可以激活固有免疫和适应性免疫系统从而发挥抗病毒作用。浆细胞样DC (Plasmacytoid dendritic cells,pDCs)是诱导干扰素-α(IFN-α)表达的主要天然免疫细胞,pDCs通过其胞内的TLR样受体(Toll-like receptors,TLR)包括TLR7和TLR9分别识别病毒的单链RNA和非甲基化的CpG (cytidine phosphate guanosine oligodeoxynucleotides) DNA从而启动下游级联信号,大量分泌Ⅰ型干扰素。而HBV是一种双链DNA病毒,在其基因组上我们发现也存在CpG序列,那么HBV是否可以通过自身CpG触发TLR9信号从而启动下游干扰素活化途径进而清除病毒呢? 基于以上问题考虑,本研究首先筛选HBV基因组来源的CpG,即HBV-CpG,探讨其诱导IFN-α表达的能力,在研究过程中还发现HBV基因组中存在富含鸟苷的抑制性寡核苷酸(ODN),即HBV-ODN,这些抑制性HBV-ODN可特异性抑制HBV-CpG诱导的IFN-α表达。进一步研究发现纳米材料PEG-PLA包裹的HBV-CpG,即NP(HBV-CpG),能拮抗HBV-ODN对IFN-a产生的抑制作用,同时探讨了NP(HBV-CpG)在预防和治疗乙型肝炎病毒感染中的作用。 在本研究中,我们首先设计了一系列HBV基因组来源的CpG序列即HBV-CpG,利用ELISA和流式细胞术的方法筛选出能诱导健康人PBMCs高表达IFN-α的HBV-CpG;之后,我们设计了HBV基因来源的富含鸟苷的抑制性HBV-ODN, ELISA方法验证其对HBV-CpG诱导IFN-α表达的能力具有特异性抑制作用,免疫荧光技术探讨了抑制性HBV-ODN的抑制机制；双乳化法将纳米材料包裹HBV-CpG形成NP (HBV-CpG), ELISA方法验证NP(HBV-CpG)逆转抑制性HBV-ODN介导的抑制活性,ELISA和流式细胞术进一步检测NP(MBV-CpG)诱导乙肝病人PBMCs表达IFN-a的情况；在小鼠模型中,利用流式细胞术检测野生型小鼠淋巴细胞的活化情况,放射性免疫法及ELISA法检测NP(HBV-CpG)联合乙肝疫苗接种野生型小鼠后的抗体应答；利用高压注射pAAV/HBV1.2质粒构建HBV携带小鼠模型,流式细胞术和ELISA法检测淋巴细胞的活化以及Ⅰ型IFN的表达,放射性免疫法检测NP(HBV-CpG)联合乙肝疫苗治疗后HBsAg和HBsAb的表达,荧光定量PCR技术检测联合治疗后HBVDNA的表达情况,免疫组化法检测联合治疗后肝脏HBcAg表达情况,H＆E染色、转氨酶及胆红素检测观察肝脏损伤情况,流式细胞术内标IFN-γ检测特异性CD8+T细胞的活化。通过上述研究方法,我们获得了以下研究结果： 1. HBV-CpG诱导人pDCs细胞高表达IFN-a 首先我们设计了一系列HBV基因组来源的CpG序列,将其分别刺激健康人PBMCs, ELISA检测上清IFN-α的表达,由此筛选出高表达IFN-α的HBV-CpG,进一步流式细胞术验证HBV-CpG是通过诱导Lineagel-, CD123+, HLA-DR+的细胞即pDCs特异性表达IFN-α,流式内标发现HBV-CpG刺激PBMCs后pDCs胞内TLR9表达上调,TLR7表达没有显著变化,内体酸化抑制剂氯喹处理后抑制了HBV-CpG诱导的IFN-α的表达。以上结果证明了HBV-CpG诱导人pDCs表达IFN-α,依赖TLR9而非TLR7的途径。 2. inhibitory HBV-ODN特异性抑制HBV-CpG诱导的IFN-a的表达 在HBV基因组上我们同时发现了一些富集鸟苷的序列,ELISA法证明这些序列具有特异性抑制HBV-CpG诱导IFN-a表达的能力,该抑制性序列命名为HBV-ODN。我们也发现这些抑制性HBV-ODN并不能抑制广谱CpG-2216诱导的IFN-a的表达,为了进一步证明HBV-ODN的抑制机制,我们应用免疫荧光技术发现HBV-ODN抑制了Gen2.2细胞对HBV-CpG的摄取及与TLR9的共定位。因此我们认为抑制性HBV-ODN特异性抑制了HBV-CpG诱导的IFN-a的表达。 3. NP(HBV-CpG)逆转HBV-ODN抑制IFN-α的表达能力 为了逆转HBV-ODN的抑制效应,我们采用纳米材料PEG-PLA包被HBV-CpG,即形成NP(HBV-CpG),当NP(HBV-CpG)与HBV-ODN以2：1的比例刺激PBMCs时,IFN-α的表达显著提高,而且NP(HBV-CpG)比HBV-CpG具有更强的活化pDCs、NK和T细胞的能力,进一步研究发现NP(HBV-CpG)同样可以诱导乙肝患者来源的PBMCs表达IFN-α。 根据以上结果我们证明HBV-CpG在纳米材料包被下可以逆转HBV-ODN抑制IFN-a的能力并且可以诱导乙肝患者PBMCs表达IFN-α。 4. NP(HBV-CpG)活化野生型小鼠的淋巴细胞 小鼠体内试验中,通过静脉注射NP(HBV-CpG)可以显著提高pDCs和cDCs表面CD40和CD80的表达,以及上调NK和T细胞表面CD69和ICOS的表达。NP(HBV-CpG)体外刺激小鼠脾脏淋巴细胞,同样提高了pDCs和cDCs表面CD40和CD80以及NK和T细胞表面CD69的表达,而且pDCs和cDCs在NP(HBV-CpG)刺激下生存能力增强。以上结果证明NP(HBV-CpG)体内体外均具有活化小鼠淋巴细胞的能力。 5. NP(HBV-CpG)协同增强乙肝疫苗的抗体应答 NP(HBV-CpG)联合rHBsAg疫苗分别免疫BALB/c和C57BL/6小鼠,同时设空载体联合rHBsAg疫苗组、单独乙肝疫苗组和未处理组做对照,免疫2和4周后放射性免疫法检测发现,NP(HBV-CpG)联合rHBsAg疫苗组抗体应答水平显著提高,ELISA检测发现Thl型抗体亚型IgG2a水平也显著增强。上述结果证明NP(HBV-CpG)增强乙肝疫苗的抗体应答特别是Th1型抗体应答。 6. NP(HBV-CpG)促进HBV携带小鼠的免疫应答 将pAAV/HBV1.2质粒高压注射C57BL/6小鼠,构建HBV携带鼠模型,NP(HBV-CpG)静脉处理HBV携带鼠显著提高了cDCs表面CD40和CD80, NK细胞表面CD69和ICOS,以及CD4+和CD8+T细胞CD69的表达,并且NP(HBV-CpG)尾静脉注射HBV携带鼠诱导了血清中IFN-α的表达。以上结果证明NP(HBV-CpG)具有活化HBV携带鼠免疫应答的能力。 7. NP(HBV-CpG)联合治疗有效清除HBV 利用上述高压注射构建的HBV携带鼠模型,探讨NP(HBV-CpG)对于乙肝病毒的清除作用,将NP(HBV-CpG)联合rHBsAg疫苗治疗HBV携带鼠,经过连续三周的治疗,90%的HBV携带鼠血清HBsAg被清除,肝脏HBcAg和血清HBVDNA表达显著下降,保护性乙肝抗体HBsAb开始表达,并且表达IFN-y的CD8+T细胞上调,提示NP(HBV-CpG)促进了CTL功能,同时肝脏HE染色显示肝脏结构正常,仅有轻微炎性浸润,血清转氨酶和胆红素检测进一步证明HBV携带鼠对这种NP(HBV-CpG)联合治疗是耐受的。 根据以上结果我们证明了NP(HBV-CpG)联合治疗HBV携带鼠可以在短期内有效清除HBV,并且促进保护性抗体的产生。
【学位单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R373.2
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 绪论 HBV天然免疫与天然免疫细胞浆细胞样DC
    1.1.浆细胞样树突状细胞
        1.1.1.pDCs的发现
        1.1.2.pDCs的发育
            1.1.2.1.pDCs谱系分化的分子机制
            1.1.2.2.pDCs发育过程是具有可塑性的
        1.1.3.pDCs的形态特征
            1.1.3.1.人和小鼠的pDCs表型特征
            1.1.3.2.人和小鼠的pDCs TLR表达差异
        1.1.4.pDCs调节免疫应答
        1.1.5.pDCs与感染性疾病
            1.1.5.1.pDCs与人类免疫缺陷病毒
            1.1.5.2.pDCs与人类肝炎病毒
            1.1.5.3.pDCs与其它病毒
        1.1.6.pDCs与人类自身免疫性疾病
    1.2.HBV持续性感染
        1.2.1.乙型肝炎病毒的分子病毒学
        1.2.2.慢性乙型肝炎的疾病进程
        1.2.3.乙型肝炎病毒的固有免疫应答
        1.2.4.乙型肝炎病毒与模式识别受体
            1.2.4.1.PRRs活化信号可抑制HBV复制
            1.2.4.2.通过干扰素诱导抗病毒效应抑制HBV复制
            1.2.4.3.通过TNF-α破坏HBV核衣壳的形成
            1.2.4.4.通过活化PRRs诱导胞内的抗病毒信号
        1.2.5.活化天然免疫应答的途径治疗慢性乙型肝炎
            1.2.5.1.TLRs和RLRs活化
            1.2.5.2.干扰素治疗
        1.2.6.乙型肝炎病毒的获得性免疫应答
    参考文献
第二章 纳米材料包被HBV-CpG对乙型肝炎病毒感染的治疗性免疫
    2.1.引言
    2.2.实验材料和方法
        2.2.1.临床样本与实验动物
        2.2.2.实验试剂
            2.2.2.1 细胞培养和细菌培养用试剂
            2.2.2.2 碟酸盐缓冲溶液
            2.2.2.3 细胞分离试剂
            2.2.2.4 HBV-CpG, HBV-ODN
            2.2.2.5 流式染色用试剂
            2.2.2.6 流式染色用抗体
            2.2.2.7 内体酸化抑制剂氯喹
            2.2.2.8 免疫焚光相关试剂
            2.2.2.9 EUSA检测试剂
            2.2.2.10 乙型肝炎病毒抗原抗体检测试剂
            2.2.2.11 乙型肝炎病毒核酸检测试剂
            2.2.2.12 H-E染色试剂
            2.2.2.13 免疫组化试剂
            2.2.2.14 抗体ELISA检测试剂
            2.2.2.15 血清转氣酶ALT及胆红素检测试剂盒
            2.2.2.16 pAAV/HBVl.2 质粒来源
            2.2.2.17 质粒抽提试剂盒
            2.2.2.18 Gen2.2 细胞来源
            2.2.2.19 MS-5细胞来源
        2.2.3.主要实验仪器
        2.2.4.试验方法
    2.3.实验结果
        2.3.1.设计HBV-CpG诱导人PBMCs表达IFN-α
        2.3.2.HBV-CpG依赖TLR9途径诱导pDCs表达IFN-α
        2.3.3.HBV-ODN抑制HBV-CpG诱导的IFN-α的表达
        2.3.4.NP（HBV-CpG）逆转抑制性HBV-ODN介导的IFN-α抑制表达
        2.3.5.NP（HBV-CpG）对野生型小鼠的淋巴细胞具有强烈的活化效应
        2.3.6.NP（HBV-CpG）协同促进rHBsAg疫苗应答
        2.3.7.NP（HBV-CpG）诱导HBV携带鼠强烈的天然免疫应答
        2.3.8.NP（HBV-CpG）联合治疗HBV携带鼠有效清除HBV
    2.4.讨论
        2.4.1.HBV基因组的CpG具有诱导IFN-α表达的能力
        2.4.2.HBV-ODNs可抑制HBV-CpG诱导的IFN-α表达
        2.4.3.纳米材料包被HBV-CpG逆转HBV-ODNs的抑制效应
        2.4.4.NP（HBV-CpG）作为佐剂促进乙肝疫苗免疫效果
        2.4.5.NP（HBV-CpG）联合乙肝疫苗应用于乙型肝炎病毒感染的治疗
        2.4.6.总结
    参考文献
致谢
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    专利申请
    学术会议

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本文编号：2857749