一组导向融合蛋白的基因工程研究

发布时间：2020-10-27 03:01

　　 很多高免疫反应的疾病中都发现有白细胞介-2受体(IL-2R)阳性细胞的浸涧和聚集，如器官移植排斥、自身免疫性甲状腺病、Ⅰ型糖尿病、类风湿性关节炎等。成人T淋巴细胞白血病细胞和爱滋病病毒HIV感染的细胞表面也含有丰富的IL-2受体。IL2受体阳性淋巴细胞在这些疾病的病理过程中起着关键性作用。因此可以通过IL-2与毒素蛋白的基因融合，表达出融合毒素用以对IL-2受体异常丰富的靶细胞进行特异杀伤，从而达到治疗疾病的目的。然而到目前为止，要将此类融合毒素导向药物推向实际临床应用却存在一个很大的障碍：大分子异源蛋白在体内的免疫原性问题。 本论文分为四个部分。第一部分：融合蛋白IL-2(60)-PEZN，IL-2(60)-PEZNK，IL-2-PEZNM，IL-2-PEZNKM，IL-2-K-PEZNM的基因构建与诱导表达。第二部分：5种融合蛋白的快速纯化、生物活性测定及融合毒素抗血清的制备。第三部分：融合蛋白IL-2-K-PEZNM的纯化制备及药理活性的初步研究。前三部分的研究对象是IL-2与绿脓毒素的融合，主要目的是利用基因工程和蛋白质工程的方法，对本室曾经构建的融合毒素IL-2(60)-PE40进行一系列的基因突变与改造，探讨融合毒素结构与功能的关系，通过对突变体的活性比较，找到最适的构建突变融合基因的方式。第四部分：新型融合蛋白IL-2-TNFαM的纯化与初步药理实验。目的是探索一条构建无免疫原性融合毒素的新路 在本文第一部分中，我们通过PCR反应、插入突变及缺失突变等方法，构建了5种融合蛋白IL-2(60)-PEZN，IL-2(60)-PEZNK，IL-2-PEZNM，IL-2-PEZNKM，IL-2-K-PEZNM的基因，绿脓毒素突变体PEZN是我们利用本实验室克隆到的PE40基因的特异性所得到的一种突变体形式以求创新，将经典的PE40删除其360-380位氨基酸而得到；突变体PEZNK是将PE40中360-380位氨基酸删除并以—段扩增于人IgG4基因的富含Lys编码的基因片段取代而得到；突变体PEZNM是在突变体PEZN的基础上删除其C末端最后一个Lys而得到。其中IL-2(60)-PEZN，IL-2(60)-PEZNK的基因分别克隆于表达质粒pT7-7的T7启动子下游，与质粒pGP1-2共转化大肠杆菌K38，温控表达，表达水平分别为18.1％，18.5％；IL-2-PE38M，IL-2-PE38KM，IL-2-K-PE38M的基因分别克隆于本室所构建的高效表达质粒pLSD13的P_L启动子下游，转化大肠杆菌DH5α，温控表达，表达水平分别为19.6％，19.8％，
【学位单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：1998
【中图分类】：R346
【部分图文】：

图4通过血清学反应确定的PE38蛋白分子的抗原决定簇区域的确定为将来消除PE的免疫原性以提高其药用价值提供以通过点突变在保留其生物活性的同时改变EP分子的抗原决刘日七学修饰的途径遮蔽其抗原决定簇，或者将点突变与化学修。毒素结构域的详解E的研究多采用蛋白工程的方法.先通过点突变或缺失突变导酸的改变，再研究其生物功能.目前对PE的分子结构及其与较深入的了解.域aI(Amnioacidl一52)

聚合酶削平，得到一个幻』、为3655b拌具有两个平末端的片段.片段自连，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，少量提取质粒，酶切，琼脂糖凝胶电泳筛选鉴定得到重红封贡粒pNL1.电泳鉴定图参见图1.2.对照哗M10经sall和Bgil双酶切，得到4个片段，2826、科2、255、162Pbs.阳性克隆经sall和Bgll双酶切，得到4个片段，2826、541、285Pbs.姻l除T绿脓毒素结构域bI中功能未知.包括一咐目互酉‘才的Cys在内的的15个氨基酸残基的编码(即编码氨基酸残基365一380肤段的基因)，另外还删除了结构域nC端5个氨基酸的编码.这种构建方式比目前流行的构建方式PE38多删除了结构域n中的5个氨基酸.操作方式简洁明了、一步到位

由于是双酶切定向克隆，重组质粒pNLZ重组率很高，其酶切电泳鉴定也较为简单，同样以sal+lBal五Hl双酶切，能够切下2919，490Pbs两个片段的质粒即为阳性克隆.如图1.4可见，2，3泳道即为阳性克隆.图1.5为DNA测序图谱3.重组质拉pL卜[3、pLN4的构建3.1通过PCR反应扩增人源富含赖氮酸编码的基因片段A模板:人gIG4重链恒定区基因片段共加28饰s克隆于PBR322质粒中.碱变性法小量提取用作模板
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本文编号：2857928