肛门失禁动物模型的构建

发布时间：2020-10-27 15:23

　　 研究背景 肛门失禁是持续性或反复发作的不能感知肠内容物性状或不能控制肠内容物的排出,包括液态、气态、固态的肠内容物,是复杂的、多因素导致的排便功能紊乱,表现为对气体或粪便控制能力的损害,导致排便次数增多,常有腹泻。这些临床症状经常导致患者拒绝参与社交活动并严重影响患者的日常生活。虽然相继提出多种手术及非手术治疗方式,但各有其局限性与缺点,顽固性肛门失禁仍然是内、外科临床上十分难处理的问题。为此,我们试图研制出一种制作肛门失禁动物模型的方法,以期望为制作肛门失禁动物模型提供一种新的思路,为治疗肛门失禁疾病的研究做好基础性工作。鉴于国内外学者目前采用的造模方法,研制的新造模方法期望达到的目标主要有:①操作简单,无需昂贵的实验仪器及实验试剂,易于推广;②微创操作,动物死亡率低;③造模效果确切、稳定。 根据既往研究成果,肛门外括约肌在排便节制中扮演着重要的角色,其支配神经为骶神经。Cosovic E等研究发现局部注射高浓度局麻药物,可使神经在1周后出现变性。局麻药物神经损害程度呈浓度依赖性,其浓度愈高,损害程度愈重,直至运动、感觉功能永久性丧失。另外,当药物浓度达到临界水平时,局麻药具有去污剂性质,可导致神经细胞膜结构破坏,此过程呈不可逆性改变。神经局部注射体积分数0.99乙醇,可导致末梢神经阻滞,应用于三叉神经痛的治疗。基于上诉理论,我们初步探索了一种新的肛门失禁动物模型的制作方法,通过功能性定位肛门外括约肌支配神经,局部注射神经毒性药物,选择性破坏肛门外括约肌支配神经,使其效应肌,即肛门外括约肌发生功能障碍,成功制作出肛门失禁的动物模型。 目的 基于操作简单、经济实用、微创操作、造模效果确切稳定的理念,研制出一种制作肛门失禁动物模型的新方法,以期望为制作肛门失禁动物模型提供一种新的思路,为治疗肛门失禁疾病的研究做好基础性工作。 方法 1、实验动物及分组8月龄健康成年雄性新西兰兔30只,体质量2.0-2.5 kg,普通级饲养。30只新西兰兔按随机数字表随机平均分为5组,对照组A(n=6),局部注射药物为生理盐水,术后8周取局部组织做病理检查;实验组B(n=6),局部注射药物为50g╱L罗哌卡因,术后4周取局部组织做病理检查;实验组C(n=6),局部注射药物为50g╱L罗哌卡因,术后8周取局部组织做病理检查;实验组D(n=6),局部注射药物为体积分数0.99乙醇,术后4周取局部组织做病理检查;实验组E(n=6),局部注射药物为体积分数0.99乙醇,术后8周取局部组织做病理检查。 2、动物的麻醉本次实验动物的麻醉均采用30g╱L戊巴比妥1ml/kg静脉注射麻醉。 3、测术前动物麻醉状态下肛管内静息压力(anal canal resting pressure,ARP)固定动物,肛门周围及骶部脱毛,肛管内置入测压水囊,连接三通管、压力标定表、压力电信号转换器、十六道生理信号采集系统PowerLab 16/30(ML880)、Dual Bio Amp/Stimulator(ML408),测动物麻醉状态下ARP。 4、功能性定位双侧第4荐神经并对肛门外括约肌行肌电图(electromyography,EMG)检查在离穿刺部位较远处安置无关电极一枚,与穿刺针及脉冲器连接形成环路,在肛门外括约肌上置2枚感应电极。将刺激电流开至1.5mA,脉冲频率1 Hz。在兔骶部扪及骶骨下部,按照第4荐神经的解剖部位进行定位穿刺。当与刺激电极相连的穿刺针进针达一定深度,出现与脉冲电流同步的肛门外括约肌收缩运动时,表明穿刺针接近或抵达第4荐神经,此时将脉冲电流关至0.5mA,肛门外括约肌仍在收缩运动,表明已刺中第4荐神经。记录电极刺入的位置、方向、深度。调整刺激电流参数设置为方波,频率1Hz,波宽50us,强度5mA。记录肛门外括约肌的EMG图形。 5、神经周围注射药物在维持上述电流刺激及监测肛管内压力变化的情况下,于定位好的第4荐神经处,回抽无血液,在两侧第4荐神经处缓慢注射药物。A组注射生理盐水0.5ml;B、C组注射50g/L罗哌卡因0.1ml/kg+肾上腺素(1:250000);D、E组注射体积分数0.99乙醇0.5ml+肾上腺素(1:250000)。均分两侧第4荐神经处注射。 6、测术后4周麻醉状态下B组、D组动物ARP麻醉并固定动物,肛门周围及骶部脱毛,肛管内置入测压水囊,连接三通管、压力标定表、压力电信号转换器、十六道生理信号采集系统PowerLab 16/30(ML880)、Dual BioAmp/Stimulator(ML408),测动物麻醉状态下ARP。 7、对术后4周麻醉状态下B组、D组动物行肛门外括约肌EMG检查在离穿刺部位较远处安置无关电极一枚,与穿刺针及脉冲器连接形成环路,在肛门外括约肌上置2枚感应电极。将刺激电流开至1.5 mA,脉冲频率1 Hz。按记录的电极刺入的位置、方向、深度刺入,观察肛门外括约肌的运动情况,必要时将电流刺激强度增加至5mA。记录肛门外括约肌的EMG图形。 8、测术后8周麻醉状态下A组、C组、E组动物ARP麻醉并固定动物,肛门周围及骶部脱毛,肛管内置入测压水囊,连接三通管、压力标定表、压力电信号转换器、十六道生理信号采集系统PowerLab 16/30(ML880)、Dual BioAmp/Stimulator(ML408),测动物麻醉状态下ARP。 9、对术后8周麻醉状态下A组、C组、E组动物行肛门外括约肌EMG检查在离穿刺部位较远处安置无关电极一枚,与穿刺针及脉冲器连接形成环路,在肛门外括约肌上置2枚感应电极。将刺激电流开至1.5 mA,脉冲频率1 Hz。按记录的电极刺入的位置、方向、深度刺入,观察肛门外括约肌的运动情况,必要时将电流刺激强度增加至5mA。记录肛门外括约肌的EMG图形。 10、标本的获取及处理术后4周处死B组、D组动物,术后8周处死A组、C组、E组动物,解剖分离肛门外括约肌、注射药物部位第4荐神经根及神经周围组织,仔细观察大体形态学改变。取肛门外括约肌、神经周围组织置于4%甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋,切片厚度10um,HE染色,于光学显微镜下观察注射药物部位第4荐神经周围组织、肛门外括约肌组织形态学变化。取注射药物部位第4荐神经,大小约1.0mm×1.0mm×1.0mm,立即投放至4℃预冷的30g╱L戊二醛溶液固定,再放置4℃保存,逐级乙醇脱水,环氧树脂包埋,切片厚度60nm,铅铀染色,于透射电镜下观察第4荐神经根细胞超微结构的改变。 11、数据读取和分析肛管内测压及肛门外括约肌EMG检查结果通过LabChart Reader V6.1读取并分析 12、统计学分析各组手术前、手术后ARP及手术前后ARP差值,以x±s形式表示,应用SPSS 13.0统计分析软件进行统计学分析,各组的术前、术后、手术前后ARP差值的比较采用方差分析,组间的多重比较采用LSD检验,α=0.05作为差异显著性水平。各组动物双侧肛门外括约肌支配神经术后神经EMG检查EMG改变是否明显,以计数资料形式表示,应用SPSS 13.0统计分析软件进行统计学分析,各组动物EMG改变明显率的比较采用双向无序R×C表资料的Fisher确切概率法检验。 结果 1、动物存活情况B组中1只动物于术后立即死亡,其余动物均存活至实验结束,于获取标本时被处死。动物术后存活率约为97%。 2、ARP及肛门外括约肌EMG的变化本实验用手术前后ARP及神经EMG的变化来衡量造模效果。5组动物术前ARP差异无统计学意义(P＞0.05),术后ARP差异有统计学意义(P＜0.05),手术前后的dARP差异有统计学意义(P＜0.05),各实验组与对照组dARP差异均有统计学意义(P＜0.05),实验组dARP均大于对照组,实验组间dARP差异无统计学意义(P＞0.05)。手术前各组动物及手术后对照组动物的肛门外括约肌EMG提示第4荐神经功能正常;手术后实验组动物肛门外括约肌EMG检查结果提示:5组动物手术后EMG改变明显率的差异有统计学意义(双侧P＜0.05),推断各组动物双侧肛门外括约肌支配神经EMG检查EMG改变明显率的差异显著,各组动物左侧EMG改变明显率分别为A组0%、B组100%、C组D组均为83.3%、E组67.7%,右侧EMG改变明显率分别为A组0%,B组100%,C组、D组、E组均为83.3%。 3、组织学改变D组、E组神经周围组织中纤维成份明显增多,少量炎症细胞浸润;A组与B、C组未见明显异常改变。各组动物肛门外括约肌均未见明显病理改变。 4、神经纤维细胞超微结构观察电镜扫描显示实验组神经轴索变性、髓鞘板层结构紊乱、空泡形成;对照组神经轴索及髓鞘超微结构正常 结论 1.肛门失禁动物模型构建方法有效局部注射神经毒性药物,选择性破坏肛门外括约肌支配神经,能够成功制作出肛门失禁动物模型; 2.肛门失禁动物模型稳定性好在术后8W时,实验组动物仍符合肛门失禁诊断标准,结合病理检查结果,肛门失禁动物模型稳定; 3.操作简单,易于推广本课题选用的实验试剂及仪器设备均为实验室常用试剂及仪器设备,易于推广。采用神经定位方式,准确、完整地破坏支配肛门外扩约肌的神经主干,迅速使肛门外扩约肌瘫痪,达到构建肛门失禁动物模型的目的,操作过程简单易行; 4.微创理念这种新型动物模型构建方法对实验动物的创伤小,术后动物死亡率低。这一微创理念符合动物实验伦理学善待实验动物的要求,具有重要的应用价值,不失为肛门失禁动物模型造模方法的进步。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R657.1;R-332
【部分图文】：

e:手术前E组动物麻醉状态下ARP e:TheARPofgrouPEbeforeoPeration图3 F19.3一1手术前各组动物麻醉状态下ARP theARPofeachgrouPbeforeoPeration

第二章肛门失禁动物模型的构建手术后通过 PowerLab16/30(ML880)对30只新西兰兔的麻醉状态下A即进行监测，结果见图3一2。卜1.1翻，知..‘......，.勺叨..厅日‘日二气违台固.川巨出翻囚口“翻.曰卜......口目..卜tl卜加.，日口卜今叼到公翻习。二，.一习竺竺{aa:手术后A组动物麻醉状态下A即 :TheARPofgrouPAafteroPeration日‘日二气性n固.目引卜曰.，苏二’;‘合

对30只新西兰兔的肛门外括约肌进行EMG检查。于刺激电信号后获得动物肛「〕外括约肌正常收缩运动的肌电信号，诱发电位波幅正常，提示第4荐神经功能正常。结果见图3一3。a:手术前A组动物麻醉状态下肛门外括约肌肌电图检查结果 a:TheEMGofgrouPAbeforeoPeration
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 潘伟华 ,施诚仁 ,金凌宇 ,吴燕 ,吴晔明 ,王玲华;人工泵式肛门括约肌节制排便的最适肠管约束压选择[J];临床儿科杂志;2001年04期

本文编号：2858699