人E-钙粘素融合蛋白基质构建干细胞微环境的研究

发布时间：2020-10-29 22:10

　　 细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间存在着复杂的联系,细胞表面的受体与细胞外微环境相互作用,决定了细胞的粘附、增殖、迁移、分化,以及特异性功能表达。近年来,组织工程和再生医学的研究取得了重要的进展,为各领域的研究拓宽了一条新的途径。利用生物材料、医用材料等仿生构建细胞外微环境的应用已经成为生物材料领域研究的重点,其中,以基因工程技术为基础的新型生物材料---融合蛋白的研制已成为设计和构建细胞外微环境生物材料研究的新方向。本论文通过生物合成人E-钙粘素融合蛋白,研究开发仿生细胞-细胞间相互作用的生物材料,并仿生构建细胞外微环境调控细胞行为,其不仅能有效推动基础生物学的研究,同时在组织工程和再生医学等领域也有广泛的应用。 首先,我们重组了人细胞间粘附分子E-钙粘蛋白(hE-cadherin)的胞外域与免疫球蛋白G(IgG)的Fc域,生物合成人E-钙粘素融合蛋白(hE-cadherin-Fc)。基因工程技术构建了融合蛋白表达载体,利用293F细胞表达体系进行了融合蛋白的表达并纯化,Elisa和western blotting检测表明我们成功制备了高纯度的hE-cadherin-Fc。进一步将融合蛋白应用于疏水材料的表面修饰,仿生构建了细胞-细胞间相互作用的生物材料细胞外微环境并用于人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的增殖及定向分化研究。接触角(WCA)及原子力显微镜(AFM)检测表明：hE-cadherin-Fc能够利用Fc结构域稳定的吸附在疏水材料表面,同时改善了材料表面的形态及亲水性,形成稳定的细胞外基质。与组织细胞培养板(TC-PS)和明胶(Gelatin)基质相比,hE-cadherin-Fc基质能显著增强hMSCs的粘附,并促进细胞增殖；同时未分化性标志物CD105的流式细胞术鉴定显示：hMSCs保持了良好的未分化性。hE-cadherin-Fc基质对hMSCs生物学行为的调控及其分子机制的进一步研究,发现融合蛋白基质显著提高了E钙粘素信号通路的相关分子表达水平,初步揭示了在细胞培养初期hE-cadherin-Fc基质与细胞间的相互作用代替了细胞-细胞间的相互作用。 其次,我们考察了hE-cadherin-Fc基质对hMSCs向肝细胞定向诱导分化的影响。在hE-cadherin-Fc基质表面hMSCs向肝细胞诱导分化培养4周后,细胞形态、肝特异性标志物基因和蛋白的表达、肝细胞分化功能表达的检测表明：不同基质条件下hMSCs均有部分细胞分化成为肝细胞样细胞,与TC-PS和Gelatin基质相比,hE-cadherin-Fc基质表面分化的肝细胞样细胞表达肝前体细胞标志物CD117的阳性细胞比例高于TC-PS和Gelatin基质表面,并且肝细胞特异性标志物基因白蛋白(ALB)、细胞角蛋白18(CK18)和肝细胞核因子4(HNF4)的分子水平表达量更高；ALB蛋白免疫荧光染色结果也证明了ALB蛋白表达与其分子表达水平相同的结果。同时,肝分化功能指标糖原储存、吲哚青绿(ICG)摄取、白蛋白和尿素分泌的检测结果表明,hE-cadherin-Fc基质显著提高了人骨髓间充质干细胞源肝样细胞分化功能的表达。本研究结果表明hE-cadherin-Fc基质与相关液性因子协同作用促进hMSCs向肝细胞定向跨胚层分化的潜能,其分子机制还有待进一步深入研究,揭示了生物材料设计对其生物学功能的影响及应用前景。 最后,我们进一步探索了hE-cadherin-Fc用于纳米纤维支架和多孔支架的生物功能改性的研究。扫描电子显微镜(SEM)的结果显示,融合蛋白的修饰没有改变支架的三维微纳米结构。X射线光电子能谱(XPS)和Elisa检测结果表明,hE-cadherin-Fc在三维支架表面有效形成了稳定的融合蛋白层。WCA结果显示hE-cadherin-Fc表面修饰显著改善了三维支架表面的亲水性；同时,hE-cadherin-Fc基质化提高了hMSCs在三维支架上的粘附与增殖。细胞骨架染色和细胞形态结果表明,在hE-cadherin-Fc表面改性支架内的细胞更接近成纤维状。此外,茜素红染色表明hE-cadherin-Fc基质表面扩增的干细胞保持了良好的分化性能。本研究表明hE-cadherin-Fc可用于三维支架表面改性,提高支架与细胞的亲和性,进一步赋予支架生物功能,显示了其在干细胞三维环境构建及生物医学领域的应用前景。 综上所述,hE-cadherin-Fc融合蛋白可用于疏水材料的表面改性,由钙粘素的同源结合介导细胞与材料粘附,通过生物材料模拟细胞间结合仿生构建人工细胞外微环境,显著改善干细胞粘附与增殖,并促进干细胞定向分化调控,为生物材料在再生医学领域的应用开辟了新的思路。
【学位单位】：南开大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R329.2
【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
第一章 前言
    第一节 组织工程的应用和发展
        1.1.1 组织工程
        1.1.2 组织工程的构成
        1.1.3 组织工程的发展
        1.1.4 组织工程存在的问题
    第二节 仿生细胞外微环境
        1.2.1 细胞外微环境
        1.2.2 生物材料仿生细胞外微环境
    第三节 细胞粘附
    第四节 种子细胞
        1.4.1 胚胎干细胞
        1.4.2 诱导多能性干细胞
        1.4.3 间充质干细胞
    第五节 本研究的设计思路、研究内容、技术路线、目的意义及创新性
        1.5.1 设计思路
        1.5.2 研究内容
        1.5.3 技术路线
        1.5.4 目的与意义
        1.5.5 本研究的创新性
第二章 人E一钙粘素融合蛋白基质对人骨髓间充质干细胞的粘附和增殖影响的研究
    第一节 引言
    第二节 实验材料与仪器
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 实验仪器
    第三节 实验方法
        2.3.1 人E-钙粘素的基因序列的分析和克隆
        2.3.2 人E-钙粘素融合蛋白克隆载体和表达载体的构建
        2.3.3 人E-钙粘素融合蛋白的表达纯化
        2.3.4 人E-钙粘素融合蛋白修饰疏水表面的表征
        2.3.5 人E-钙粘素融合蛋白吸附稳定性的分析
        2.3.6 人骨髓间充质干细胞的培养
        2.3.7 人E-钙粘素融合蛋白基质表面人骨髓间充质干细胞粘附和增殖的鉴定
        2.3.8 人E-钙粘素融合蛋白基质表面细胞粘附的钙离子依赖性分析
        2.3.9 人E-钙粘素融合蛋白基质表面人骨髓间充质干细胞形态的分析及量化
        2.3.10 人E-钙粘素融合蛋白基质表面人骨髓间充质干细胞的传代分析
        2.3.11 人E-钙粘素融合蛋白基质表面人骨髓间充质干细胞未分化性的分析
        2.3.12 人E-钙粘素融合蛋白基质表面人骨髓间充质干细胞分子水平表达的分析
        2.3.13 实验数据统计与分析
    第四节 实验结果
        2.4.1 人E-钙粘素融合蛋白表达载体的构建及鉴定
        2.4.2 人E-钙粘素融合蛋白的表达纯化及鉴定
        2.4.3 人E-钙粘素融合蛋白基质吸附浓度
        2.4.4 人E-钙粘素融合蛋白修饰疏水表面
        2.4.5 人E-钙粘素融合蛋白吸附的稳定性
        2.4.6 人E-钙粘素融合蛋白基质表面人骨髓间充质干细胞的粘附
        2.4.7 人E-钙粘素融合蛋白细胞粘附的钙离子依赖性
        2.4.8 人E-钙粘素融合蛋白基质表面人骨髓间充质干细胞的形态
        2.4.9 人E-钙粘素融合蛋白基质表面人骨髓间充质干细胞的增殖
        2.4.10 人E-钙粘素融合蛋白基质表面人骨髓间充质干细胞的传代培养
        2.4.11 人E-钙粘素融合蛋白基质表面人骨髓间充质干细胞的未分化状态
        2.4.12 人E-钙粘素融合蛋白基质表面人骨髓间充质干细胞相关信号通路的基因表达
        2.4.13 人E-钙粘素融合蛋白基质的作用机理
    第五节 讨论
    第六节 本章小结
第三章 人E-钙粘素融合蛋白基质对人骨髓间充质干细胞向肝细胞定向分化影响的研究
    第一节 引言
    第二节 实验材料与仪器
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验仪器
    第三节 实验方法
        3.3.1 人E-钙粘素融合蛋白基质稳定性的分析
        3.3.2 人骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化
        3.3.3 流式细胞术分析
        3.3.4 人骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化后分子水平的鉴定
        3.3.5 人骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化后蛋白水平的鉴定
        3.3.6 糖原染色分析
        3.3.7 ICG的摄取实验
        3.3.8 白蛋白测定
        3.3.9 尿素测定
        3.3.10 实验数据统计与分析
    第四节 实验结果
        3.4.1 人E-钙粘素融合蛋白基质的稳定性
        3.4.2 不同基质表面人骨髓间充质干细胞向肝细胞的定向分化
        3.4.3 不同基质表面人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的效率
        3.4.4 不同基质表面人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的肝特异性基因的表达
        3.4.5 不同基质表面人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的肝特异性蛋白的表达
        3.4.6 不同基质表面人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的糖原染色
        3.4.7 不同基质表面人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的ICG摄取
        3.4.8 不同基质表面人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化后肝功能的表达
    第五节 讨论
    第六节 本章小结
第四章 人E-钙粘素融合蛋白修饰PCL纳米纤维支架对人骨髓间充质干细胞影响的研究
    第一节 引言
    第二节 实验材料与仪器
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验仪器
    第三节 实验方法
        4.3.1 取向性非取向性PCL纳米纤维支架的制备
        4.3.2 扫描电子显微镜观察
        4.3.3 X射线光电子能谱分析
        4.3.4 接触角实验
        4.3.5 人E-钙粘素融合蛋白在纳米纤维支架表面吸附稳定性的分析
        4.3.6 人骨髓间充质干细胞在PCL纳米纤维支架中粘附和增殖的鉴定
        4.3.7 细胞骨架染色
        4.3.8 人骨髓间充质干细胞在PCL纳米纤维支架中向成骨细胞的分化
        4.3.9 实验数据统计与分析
    第四节 实验结果
        4.4.1 PCL纳米纤维支架的形态
        4.4.2 PCL纳米纤维支架的表面形态
        4.4.3 人E-钙粘素融合蛋白基修饰PCL纳米纤维支架的元素分析
        4.4.4 人E-钙粘素融合蛋白修饰PCL纳米纤维支架的亲水性
        4.4.5 人E-钙粘素融合蛋白在PCL纳米纤维支架的吸附稳定性
        4.4.6 人E-钙粘素融合蛋白修饰PCL纳米纤维支架后人骨髓间充质干细胞的粘附
        4.4.7 人E-钙粘素融合蛋白修饰PCL纳米纤维支架后人骨髓间充质干细胞的增殖
        4.4.8 人E-钙粘素融合蛋白修饰PCL纳米纤维支架后人骨髓间充质干细胞的形态
        4.4.9 人E-耗粘素融合蛋白修饰PGL纳米纤维支架后人骨髓间充质干细胞的分化性
    第五节 讨论
    第六节 本章小结
第五章 人E-钙粘素融合蛋白修饰多孔支架对人骨髓间充质干细胞影响的研究
    第一节 引言
    第二节 实验材料与仪器
        5.2.1 实验材料
        5.2.2 实验仪器
    第三节 实验方法
        5.3.1 PCL、PLGA和PCL/PLGGA支架的制备
        5.3.2 人骨髓间充质干细胞的鉴定与培养
        5.3.3 多孔支架的消毒处理
        5.3.4 人E-钙粘素融合蛋白修饰多孔支架
        5.3.5 扫描电镜观察细胞在支架表面的粘附和生长
        5.3.6 人E-钙粘素融合蛋白修饰多孔支架后人骨髓间充质干细胞的粘附和增殖
        5.3.7 实验数据统计与分析
    第四节 实验结果
        5.4.1 多孔支架的形态
        5.4.2 人E-钙粘素融合蛋白修饰多孔支架后人骨髓间充质干细胞的粘附
        5.4.3 人E-钙粘素融合蛋白修饰多孔支架后人骨髓间充质干细胞的增殖
        5.4.4 人E-钙粘素融合蛋白修饰多孔支架后人骨髓间充质干细胞的形态
    第五节 讨论
    第六节 本章小结
第六章 全文总结
参考文献
致谢
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

【共引文献】

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