HIF1-VEGF在小鼠月经样模型月经发生中的调控机制研究

发布时间：2020-10-30 08:55

　　 月经是包括人类的高等灵长类以及少数其它胎盘动物所特有的子宫内膜周期性脱落的生理现象。解析子宫内膜周期性崩解出血与修复机制是理解异常出血机制和寻找治疗异常出血策略的关键所在,对女性生殖健康具有重大的意义。 关于月经的早期研究可以追溯到1940s,Markee利用恒河猴子宫内膜外植体模型,直观地观察到子宫内膜在月经周期中的变化。Markee观察到在月经发生前,子宫内膜中的螺旋动脉发生约24h的痉挛收缩。由此推测,组织缺血缺氧是造成子宫内膜崩解的始动原因。由于长期缺乏理想的模式动物模型,月经机制的研究进展较为缓慢。八十年代,最常用的哺乳类模式动物——小鼠首次被带入月经机制的研究领域。本世纪初,小鼠月经样模型已经得到优化。在2007年,本实验室成功建立了小鼠药理性孕酮撤退月经样模型,并且对月经的发生机制进行了前期的探索性研究。在对小鼠月经样模型孕酮撤退后的不同时间点进行Pathway Finder芯片检测后,在芯片数据解析中发现,低氧反应相关基因和血管内皮生长因子(Vegf) mRNA的表达量在子宫内膜的崩解过程中逐渐增高。对12h和16h两个处理组进行全基因组表达谱芯片检测,GO分析(Gene Ontology)中发现,在这两个处理组中,与低氧反应有关的基因数目较多,其中低氧诱导因子Hif1α和Vegf mRNA表达升高显著。 本研究以小鼠生理性孕酮撤退月经样模型和小鼠／人蜕膜化子宫内膜基质细胞模拟激素撤退为基础,探讨了孕酮撤退、低氧、HIF1A(低氧诱导因子)与VEGF(血管内皮生长因子)在月经发生过程中的调控关系。主要结果如下： 1.在小鼠月经样模型与体外培养模拟月经发生的小鼠／人蜕膜化子宫内膜基质细胞中,孕酮撤退造成Hif1αmRNA的上调,并且HIF1A在细胞核内的表达量升高,即HIF1A的功能被激活。孕酮撤退后,VegfmRNA表达与蛋白质表达量均升高。 2.在小鼠月经样模型的崩解期(0-24h),HIF1A与VEGF蛋白质的定位具有相关性。进一步检测发现,HIF1A与Vegf的启动子区域直接结合的相对量在P4撤退后升高,峰值在12h出现,与Vegf mRNA表达的峰值时间相同。说明在小鼠月经样模型崩解期,HIF1A直接调控Vegf mRNA的表达。小鼠月经样模型的崩解期(0-24h),抑制HIF1A后,子宫内膜中VEGF蛋白质的表达量降低,同时,子宫内膜的崩解受到抑制。此结果证实了HIF1A对子宫内膜的崩解具有重要作用,并且P4撤退能够通过HIF1A上调Vegf基因的表达。 3.在小鼠月经样模型的修复期(32-48h),HIF1A与VEGF蛋白质的定位相一致。进一步检测发现,HIF1A与Vegf的启动子区域直接结合的相对量在32h显著高于48h(P0.05)。说明在小鼠月经样模型修复期,HIF1A直接调控Vegf mRNA的表达。小鼠月经样模型的修复期(0-32h),抑制HIF1A后,子宫内膜中VEGF蛋白质的表达量降低,同时,子宫内膜的修复受到抑制。此结果证实了HIF1A对子宫内膜的崩解具有重要作用,并且P4撤退能够通过HIF1A上调Vegf基因的表达。 4.在体外培养的小鼠/人蜕膜化子宫内膜基质细胞中,模拟激素撤退后导致Vegf表达量的上调,而在敲降Hifla后Vegf的表达受到抑制。此结果在细胞水平证实了,在P4撤退后,HIF1A对蜕膜化子宫内膜基质细胞中具有重要作用,并且P4撤退通过HIF1A上调Vegf基因的表达。 5.首次在小鼠月经样模型崩解期,检测到子宫内膜中低氧的存在。低氧区域随着子宫内膜崩解的进程逐渐扩大。在小鼠月经样模型模拟低氧后,未能导致子宫内膜的崩解,证实低氧不是子宫内膜崩解的起始因素。 6.在低氧区域,HIF1A在小鼠月经样模型崩解期大量表达于细胞核内。低氧、HIF1A与VEGF蛋白质的表达定位存在相关性。小鼠/人蜕膜化子宫内膜间质细胞体外培养,在模拟低氧和低氧培养条件下均能激活HIF1A并上调Vegf mRNA与蛋白质的表达,而敲降Hiflα后Vegf的表达受到抑制。说明低氧能够通过激活HIF1A调控VEGF的表达。 本论文中还涉及了小鼠月经样模型中NF-KB与COX-2的相关研究。研究发现,COX-2抑制剂能够显著抑制子宫内膜的崩解,并显著降低COX-2的酶活性和体内前列腺素PGF2a的含量。NF-κB(P50和P65)与COX-2在小鼠月经样模型中定位存在相关性。进一步利用NF-κB抑制剂干预小鼠月经样模型,得到COX-2抑制剂相似的表型,COX-2mRNA的表达量也显著降低,提示P4撤退后,NF-κB调控COX-2的表达。NF-κB和COX-2抑制剂均能抑制白细胞在子宫内膜崩解期的侵润,提示崩解过程中NF-κB通过调控COX-2增加PGF2a,而引发白细胞侵润以促进子宫内膜的崩解。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R711.51;R-332
【部分图文】：

剧烈震荡15s。室温静置2~3min再1管，此时管内溶液由下至上分为3层，即粉色有溶于无色水相中。小心地吸出上层液体（避免吸的1.5ml RNase-Free的EP管中。ml, -20°C预冷的异丙醇，EP管上下颠倒混勾，沉30min (亦可-20°C保存过夜，取出回复室温再进高速离心lOmin，小心弃上清，防止位于EP管底乙醇（100%乙醇与DEPC水配制），轻弹管壁，心5min，小心弃上清。，自然干燥RNA (避免完全干燥，不利于RNC水，轻轻吹打片刻，室温静置lOmin,使RNA量0D值，OD260/280大于1.8?2.0即判定RNA电泳确定RNA的完整性（见图1-2)。

④37°C温箱孵育30min，在酶标仪562mn波长检测0D值；以标准液浓度的0D值绘制标准曲线（见图1-5)，依此计算测得样品浓度。2.5 1 y= 1.1107X-0.1137R2 = 0.9983 AI ： Z0> J Zw ZI 0.5 -工 0 ——, , , ,0.00 0.50 1.00 1.50 2.00O.D.图1-5蛋白质浓度直线图(3)蛋白变性：根据测得浓度，计算所需的蛋白量（约30?50mg/样品），加入5Xloading buffer，置于沸水中解育5min，使蛋白充分变性。(4) SDS-PAGE 凝胶电泳及 Western blot①按照上述SDS-PAGE凝胶配制方法制胶，待胶充分凝固后，组装好放入电泳槽中，并缓慢加入足量电泳缓冲液，避免产生过多泡沫；用微量注?

口在干净的吸水纸上，轻敲几次，使液体尽可能被吸净。加入lOOjiL Substrate Solution,室温孵育30min (注意此步加入lOOi^L的Stop solution。小孔中的液体颜色由蓝色变颜色呈现绿色或者颜色转变不均勾，可轻轻敲打或在桌面小孔中的液体混充分勾。后30min内测定0D值。将酶标仪设置为450nm吸收光。设定为540~570nm。若波长矫正不可用，则分别检测波长54n波长吸收光下的值，再将数值代入以下公式：0D最终值=OD450 — OD540 或 570矫正的0D45()可能比真实值高一些，造成不准确。量的样品计算平均值，减去空白对照（Blank)。用VEGF实际浓度，计算出标准浓度曲线（见图1-6)。根据标准曲品的0D值代入公式，计算出样品的VEGF的浓度。若样乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度。1,200 1
【参考文献】

相关博士学位论文 前2条

1 李云峰;NF-κB信号通路在RU486诱导小鼠月经模型月经发生早期过程中的作用[D];北京协和医学院;2011年

2 徐祥波;药理性孕酮撤退建立小鼠月经模型及其初步研究[D];中国协和医科大学;2008年

本文编号：2862246