幽门螺杆菌多亚单位融合疫苗的实验研究

发布时间：2020-10-30 04:26

　　 目的： 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种全世界范围的人类感染病原菌，对人类健康构成严重危害。本研究拟通过生物信息学方法和体外尿素酶活性中和试验筛选稳定的能够替代全长尿素酶B(UreB)亚单位的活性片段，在此基础上将片段与另外两个已确定的Hp保护抗原成分热休克蛋白A(HspA)、鞭毛粘附素蛋白A(npak)构建融合基因。通过不同表达系统得到多亚单位的蛋白和基因疫苗，分别观察在小鼠体内诱导的不同免疫应答和保护作用，为揭示Hp潜在的保护性机制以及新型多亚单位Hp疫苗的研制提供理论和实验依据。 方法： 1．通过生物信息学方法对尿素酶B亚单位蛋白亲水性、抗原性和结构功能域等进行分析，结合尿素酶B亚单位蛋白的三级结构X射线衍射图，依据尿素酶B亚单位蛋白功能、结构稳定性，选择能够替代全长亚单位的活性片段。 2．采用PCR方法从HpCQ9803基因组中扩增目的片段基因(UreB414)并构建到原核表达载体pET-28a(+)，通过酶切、测序鉴定阳性重组子。将阳性重组子转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，Tris-trcine PAGE及免疫印迹确定目的蛋白表达。Antheprot V 5.0软件分析蛋白性质，AKTA纯化仪纯化融合蛋白。将纯化片段免疫家兔制备高免血清，对免疫后血清通过体外尿素酶中和试验检验片段的生物学活性。 3．http://mathbio.nimr.mrc.ac.uk蛋白linker库中选择合适的蛋白linker，采用重叠延伸的方法，以HspA为融合蛋白前端，将HspA、HpaA及UreB活性片段依次串联，酶切及测序鉴定连接结果，NcoI、XhoI双酶切将融合基因构建到原核表达载体中。SDS-PAGE电泳和免疫印迹鉴定融合蛋白表达，软件分析融合蛋白理化特性，通过包涵体洗涤，纯化条件摸索，AKTA纯化仪纯化融合蛋白。 4．将160只小鼠随机分为4组：融合蛋白组(HspA-HpaA-UreB414)、三亚单位物理混合组(HspA+HpaA+UreB)、单一尿素酶组(UreB)和PBS对照组。以LT无毒突变体为佐剂，分别于O、7、14、28天免疫接种，剂量为150μg／只／次。末次免疫后10天，每组取10只小鼠剖杀取样，ELISA检测口服免疫后血清特异IgG、IgA、IgGl、IgG2a， 第三军医大学博士学位论文 粪便、胃肠道冲洗液slgA，EISp0T法检测小肠Pp结19卉^sc、xgG一^se数目，盯一PeR 检测脾脏淋巴细胞IL一4，正N一Y水平。每组余下30只口服10scFu Hp动物适应株，30 天后通过Hp培养、快速尿素酶试验、涂片及特异性PCR检测小鼠胃部标本并计算口服 免疫后各组攻毒保护率。 5，将融合基因构建到真核表达载体pCDNA3.1(+)，酶切及测序鉴定得到阳性重组 子。磷酸钙法将阳性重组子转染COS一7细胞，RT一PCR方法确定了融合基因在细胞中的 表达。40只BALB/c小鼠，随机分为2组，大量抽提质粒，分别以空质粒载体和阳性重 组子质粒，按照O、21、42天各一次，每次100林g/.q/次胫前肌注射的方案免疫接种小 鼠，在末次免疫后30天依前法检测免疫后血液、胃肠道冲洗液标本指标及攻毒保护率。 结果: 1.选择了从UreB蛋白中5’端251位氨基酸到389位氨基酸的138个氨基酸为目的 片段UreB414，该片段含有己确定的CHHLDKSIKEDV12肤的尿素酶活性相关位点。 2.成功构建目的片段的表达载体pET一28a-UreB414，目的片段分子量约为巧.SKD， 包涵体鉴定试验证实为可溶形式表达，纯化后得到90%纯度的目的蛋白，.蛋白免疫家 兔后产生的抗体在体外能够中和尿素酶活性。 3.成功构建了包含HsPA、HpaA、UreB414三个Hp保护性亚单位的融合基因，不 同基因组分之间以R场甲PP6氨基酸linker的相应碱基连接，该U川沈r为非螺旋刚性蛋 白linker。 4.得到融合蛋白表达载体phhu，表达的融合蛋白具有三个亚单位蛋白各自的免疫 反应性，分子量约为43.9KD。UVP扫描证实融合蛋白表达约占总蛋白的26%。包涵体 鉴定试验证实融合蛋白以包涵体形式表达，确定了采用亲和层析、离子交换层析相结合 的纯化方法。纯化后得到纯度85%的融合蛋白。 5.融合蛋白组血清IgG、IgA，粪便，胃肠道冲洗液slgA水平，肠道PP结IgA一Asc、 IgG一AsC细胞数量与PBs组相比，升高明显，差异非常显著(P0 .001)，与三个亚单位 蛋白物理混合组相比，无明显差别(P0.05)，血清IgGI、IgGZa，脾脏淋巴细胞体外Hp 刺激后IL一4，正N一Y的水平都明显增高。融合蛋白组、三个亚单位物理混合组和单一蛋 白组小鼠的攻毒保护率分别为89.6%、72.3%和65.5%。 6.转染后融合基因能够在细胞中的表达。与空质粒免疫对照组相比，融合基因免 疫组小鼠血清IgG、IgA显著升高(P0.001)，粪便，胃肠道粘液slgA未见升高，血清IgG 以IgGZa升高为主。动物攻毒保护率为88.75%。 结论: 第三军医大学博士学位论文 1.通过理论预测及尿素酶体外中和试验实验得到性质稳定能够替代全长尿素酶B 亚单位的活性片段UreB414。 2.重组融合蛋白经口服免疫后激发的为一种Thl、Th:平衡的免疫应答模式小鼠免 疫应答，攻毒保护试验取得89.6%的保护率。融合蛋白组小鼠的攻毒保护率显著高于单 一蛋白组(P二0.0283)。 3.Hp多亚单位融合基因DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠，诱导产生一种以Th;为主 ?
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R392
【部分图文】：

一、尿素酶B亚单位结构分析结果蛋白功能结构分析中认为尿素酶B亚单位蛋白中从319位氨基酸到335位氨基酸为尿素酶活性位点，如图1一2所示，尿素酶B蛋白晶体衍射图和二级结构分析确认尿素酶B蛋白从250位氨基酸到390位氨基酸之间共有5个a螺旋，251位氨基酸和389位氨基酸分别为2个。螺旋的起点和终点，对片段的稳定性有很大的作用，亲水性、抗原性分析认为该片段区域抗原性强，大多位于整个蛋白表面。箭头所指为尿素酶活性相关区域。如图1一1，1一3图1一1尿素酶B亚单位蛋白质3级结构晶体衍射图Figl一1theanalysisofProteinUreBwithX一ray

(2690bP)7:DNAMarkerDL15，000bP图1一5重组克隆质粒酶切鉴定Figl一5Id曲tifieationofreeombinantPlas而dsbyrestrietionendonucleaseanalysis

2:100bPDNAladderm田)kef图1一4琼脂糖凝胶电泳检测UreB414片段基因的PCR扩增产物Figl一4PCRProduetofUreB414segmenifromHPstrainsresolvedbyZ·0%agarosegeleleetrOPhoresis.三、UreB414PcR产物克隆载体构建结果克隆连接反应中controlins叭DNA连接对照平板布满细菌，阴性对照平板无菌落出现，连接产物平板有蓝、白斑菌落生长。白斑菌落质粒经Nco卜乃of双酶切鉴定呈现两条片段，小片段约为400bp，大片段与蓝斑质粒经BamHI单酶切片段大小一致，约为2690bP左右。见图l一5。1234567l:loobpDNAladderm盯ker2:PCRProduetofHPstrains(414饰)2，500bP3，4
【引证文献】

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本文编号：2861986