人增殖细胞核抗原基因的转录调控研究

发布时间：2020-10-30 14:19

　　 增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是一种在DNA复制、DNA修复、细胞周期调控等机制中发挥重要功能的核蛋白，我们对人增殖细胞核抗原（human proliferating cell nuclear antigen，hPCNA）基因.538~+60区域启动子的调控做了比较全面的分析，着重研究了5′启动子中的血清刺激应答元件以及PCNA在细胞周期DNA损伤检查点（check point）机制中的转录调控。 PCNA的合成在细胞周期中受严格调控。我们通过检测hPCNA启动子报告基因在同步化L-02细胞中的瞬时表达，分析了.538~+60范围内17个潜在元件对血清刺激启动子上调的贡献。发现位于.84~.75位的5′-TTCCCCGCAA-3′ 类E2F序列是血清诱导启动子上调的应答元件。在凝胶阻滞实验中，L-02核抽提物与含有.84~.75位类E2F序列的寡核苷酸形成两个结合条带，其中含量较少、分子量稍小的条带代表S期特异复合物，可被E2F-1抗体干扰。这是对hPCNA 5′启动子区域中血清应答元件的首次描述。 4-Nitroquinoline N-oxide（4-NQO）是一种很强的致突变剂和致癌物。DNA损伤检查点是细胞周期中的重要控制机制，它能够随时应答DNA损伤信号，休止细胞周期，诱导DNA修复。为了研究PCNA这一DNA复制、修复机器中的必需因子在DNA损伤检查点机制中的表达调控，我们研究了PCNA对4-NQO所致DNA损伤的应答。首先用瞬时转染的方法检测了Hep G2细胞中4-NQO 1 WP=4 对hPCNA启动子转录调控的影响，发现4-NQO在0~2 μmol/L浓度范围内，以剂量依赖的方式通过–236~–217位p53结合元件激活hPCNA启动子转录，该转录激活作用需要p53蛋白参与。Western blot数据显示，4-NQO处理Hep G2细胞后15位丝氨酸磷酸化的p53大大增长，相比之下p53含量较处理前仅有少许增长。用丝氨酸/苏氨酸蛋白酶抑制剂staurosporine与4-NQO共同处理细胞后，磷酸化p53的大幅提高和hPCNA启动子对4-NQO的敏感性同时消失，提示15位丝氨酸磷酸化的p53是使PCNA应答4-NQO的调控蛋白。[3H]-TdR掺入实验和单细胞凝胶电泳分析显示，4-NQO作用后，细胞内DNA复制被抑制，而DNA修复被激活，上调的PCNA参与DNA修复。这一工作对4-NQO处理所致的细胞内应答，尤其是PCNA的转录调控，以及该调控机制的生理意义作了比较深入的研究。 hPCNA作为一个看家基因，需要在不同细胞的各种生理状态下广泛地表达。我们利用报告基因系统检测了hPCNA启动子.538~+60区域内的17个潜在元件在HeLa、Hep G2、MCF7、L-02细胞中对启动子活力的贡献，发现.45位ATF位点是hPCNA启动子通用的转录元件；位于.210~.75区域的6个相邻元件：.199类RA位点、.186 SP1位点、.139 CTF位点、.122 SP1位点、.94 CTF位点和.75 E2F位点突变hPCNA启动子活力也有较大影响，且存在一定的细胞特异性；.498类Ets-1位点、.216 p53位点、.64类AP2位点和+38类E2F位点对启动子活力的贡献在不同细胞株中差异较大，是细胞类型特异的转录元件。同时，我们还构建了.94 CTF位点和.75 E2F位点双突变的报告质粒，对相邻转录元件之间的协同作用进行了初步的分析。
【学位单位】：中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
【学位级别】：博士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R346
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
缩略词表
引言
第一部分 人增殖细胞核抗原基因5′启动子内的E2F元件应答血清刺激依赖的转录上调
    前言
    材料和方法
    结果
    讨论
第二部分 p53应答4-Nitroquinoline N-oxide处理激活人增殖细胞核抗原的DNA修复功能
    前言
    材料和方法
    结果
    讨论
第三部分 人增殖细胞核抗原在HeLa、HepG2、L-02、MCF7细胞中的顺式转录元件
    前言
    材料和方法
    结果
    讨论
参考文献
结论
致谢
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本文编号：2862598