小鼠胚胎干细胞建系新方法及TFAG促进鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的初步研究

发布时间：2020-10-31 19:34

　　 目的 利用小鼠胚胎着床初期1～3天子宫组织块培养分离内细胞团，探讨获得胚胎干细胞的可能性及白蒺藜醇甙(TFAG)对小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的影响。 方法 分离小鼠胚胎着床初期1～3天(孕4.5～6.5天)小鼠子宫，剪碎后进行组织块培养，2天内分离内细胞团，以后按常规的胚胎干细胞培养及传代方法进行传代。分化诱导实验是将小鼠胚胎干细胞在无白血病生长抑制因子(LIF)及无MEF饲养层条件下形成类胚体(EB)，将EB打散成单细胞，分组添加维甲酸(RA)及TFAG，种植于粘附性的组织培养皿中，诱导分化4天，进行细胞形态观察及苔盼蓝活细胞计数；再在无RA及TFAG的条件下培养2天后用抗小鼠NF200及GFAP抗体进行免疫组化鉴定。 结果 用这种方法已建立一株小鼠胚胎干细胞系，传至第10代，AKP染色强阳性，RT-PCR证实Oct-4表达强阳性。分化诱导实验中，各组均加相同浓度RA，其浓度为5×10~(-7)mol/L，不加TFAG的对照组活细胞计数为5.5×10~4/ml，转化的细胞40％为神经元细胞，10％为神经胶质细胞；与对照组比较，实验组TFAG在浓度分别为5×10~(-3)g/L、5×10~(-4)g/L、5×10~(-5)g/L、5×10~(-6)g/L时，活细胞计数分别为对照组的11.9、6.2、2.8、1.2倍，转化的神经元细胞所占比例分别为对照组的1.9、1.6、1.4、1.1倍，转化的神经胶质细胞所占比例无变化。 结论 1．小鼠胚胎着床初期1～3天子宫组织块培养可以分离出未分化的内细胞团，获得胚胎干细胞；与传统方法相比，这种新方法极大简化了实验步骤，降低了实验技术难度。2．TFAG可明显加快转化的神经细胞生长，高浓度时可诱导EB细胞向神经元细胞转化。
【学位单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R329
【部分图文】：

养4天后子宫内膜组织团块。4ES细胞体外诱导分化4.1ES细胞在无LIF条件下培养4天后明显可见EB形成，悬浮生长，如图1一12(P，。)所示。4.2EB细胞团经RA诱导后，向神经细胞分化的形态特征:EB细胞离散成单层，单纯经RA诱导后第48小时就可见部分神经样细胞，并有神经样突起;第96小时可见有神经突起的延长，并有大量死亡细胞碎片;再进行消化后培养两天，细胞在数量及形态上有较大改变;经免疫组化证实可见较多NFZOO阳性细胞，如图1一13(P19)所示。

图1一9小鼠I以团AKP染色。小鼠子宫剪碎后加ES培养基培养，第四天形成明显的工CM细胞团，AKP染色呈强阳性(100x)图1一10第10代ES细胞团AKp染色。无饲养层培养可形成明显的ES细胞团，AKP染色呈强阳性(400x)图卜12Es细胞在无LIF条件下4天后明显可见EB形成，图1一13EB细胞单纯经RA诱导后用NFZoo免疫组呈悬浮生长，细胞团不规则椭圆形，边缘似有分化(200x)化证实可见神经元细胞，NFZoo阳性〔100x)

博士学位论文第一部分图1一9小鼠I以团AKP染色。小鼠子宫剪碎后加ES培养基培养，第四天形成明显的工CM细胞团，AKP染色呈强阳性(100x)图1一10第10代ES细胞团AKp染色。无饲养层培养可形成明显的ES细胞团，AKP染色呈强阳性(400x)图卜12Es细胞在无LIF条件下4天后明显可见EB形成，图1一13EB细胞单纯经RA诱导后用NFZoo免疫组呈悬浮生长，细胞团不规则椭圆形，边缘似有分化(200x)化证实可见神经元细胞，NFZoo阳性〔100x)图卜IEB细胞经RA和5、10一3昨的TFAG诱导后神经细胞生长旺盛，免疫组化证实可见大量NF200阳性细胞(400X)图2-2EB细胞经RA和sug/L的TFAG诱导后免疫组化证实可见典型神经元细胞
【引证文献】

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本文编号：2864410