乙型肝炎病毒表面抗原抑制TLR2和TLR4信号通路的机制研究

发布时间：2020-11-01 03:47

　　 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)是一种严重危害人类健康的病原体。全球目前有超过3.5亿的乙肝病毒携带者,约90%的婴幼儿和5%的成年人在感染HBV后会发展为慢性感染,其中部分慢性HBV感染会进一步发展成肝硬化甚至肝癌。研究认为,HBV慢性持续性感染与宿主不能形成有效的抗病毒反应有关,但具体的机制并不十分明确。Toll样受体(Toll-Like Receptors, TLRs)作为一种重要的模式识别受体在对抗病毒感染的过程中发挥着举足轻重的作用。已有文献报道,HBV在长期的进化过程中形成了多种拮抗TLRs反应的策略以逃逸机体的天然免疫反应,形成持续性的感染。本课题组前期的研究表明,慢性乙型肝炎感染患者外周血单个核细胞(PBMCs) TLR2和TLR4配体诱导的细胞因子产生能力受损,并且其细胞因子的产生能力与外周血中的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)浓度呈负相关,提示HBsAg在抑制TLR2和TLR4配体诱导细胞因子产生中发挥重要的作用。为了确认HBsAg抑制TLR2和TLR4配体诱导的细胞因子产生的现象并探索其中的具体机制,本课题使用THP-1巨噬细胞模型进行了深入的研究。首先研究了HBsAg对TLR2和TLR4介导细胞因子产生的影响,发现HBsAg可以以剂量依赖性的方式抑制TLR2介导的IL-12的产生,对IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10没有明显影响。与对TLR2的影响有所不同,HBsAg在显著抑制TLR4介导的IL-12的同时,亦对II-6及TNF-α的产生也有明显抑制作用。TLR2与TLR4中的NF-κB通路与MAPK通路是调节细胞因子产生的主要通路,研究发现与选择性抑制TLR2介导的IL-12产生相对应的是HBsAg只选择性的抑制了MAPK-JNK通路的激活,对NF-kB、MAPK-p38及MAPK-ERK通路的激活没有明显影响,而对于TLR4,HBsAg除能显著抑制MAPK-JNK通路激活外,亦对NF-κB通路、MAPK-p38通路激活有普遍的抑制。由于目前已有研究表明HBsAg可以通过影响TLR4介导NF-KB通路和MAPK通路抑制TNF-α等细胞因子的产生,而HBsAg对TLR2信号通路的影响尚未有相关报道,为此主要集中于HBsAg抑制TLR2介导的IL-12产生的机制研究。IL-12是一种在抗病毒反应中极为重要的细胞因子,HBsAg选择性的抑制TLR2介导的IL-12的产生及JNK通路的激活,提示JNK通路的激活与IL-12的产生密切相关。分析表明,IL-12启动子上有JNK激酶下游转录因子c-Jun的结合位点,表明JNK在调节IL-12产生中发挥重要作用,本课题使用JNK磷酸化的特异性抑制剂SP600125,发现其能特异性抑制JNK的激活及IL-12的产生,间接证明了HBsAg通过影响TLR2介导的JNK的磷酸化从而抑制IL-12的产生。除THP-1巨噬细胞外,本研究从健康人PBMC中分离出单核细胞并分化为巨噬细胞,发现HBsAg对人巨噬细胞中TLR2介导的JNK的磷酸化及IL-12产生也具有显著抑制作用。此外,本课题收集了23例慢性乙肝患者及16例健康志愿者的外周血样本,检测比较了PBMC及CD14+单核／巨噬细胞中TLR2介导的JNK激活及IL-12产生情况,发现与健康志愿者相比,慢性乙肝患者PBMC及CD14+单核／巨噬细胞中TLR2介导JNK的激活及IL-12的产生能力受损,进一步验证了HBsAg对TLR2通路的抑制效应。无论对于TLR2还是对于TLR4, HBsAg具体如何抑制NF-κB通路和MAPK通路的激活,目前还不清楚。为此本课题进一步研究了HBsAg抑制TLR2和TLR4信号通路的作用环节及分子机制。首先发现HBsAg可以在一定程度上影响TLR2和TLR4细胞膜上受体的表达,另外也发现HBsAg可以以甘露糖受体依赖性的方式被巨噬细胞有效的内吞,使用内吞抑制剂及甘露糖阻断HBsAg进入细胞后,发现HBsAg的抑制作用被显著削弱,表明除下调受体外,HBsAg主要通过进入巨噬细胞发挥抑制作用。SHP-1/Src是一对重要的蛋白酪氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸激酶,在TLRs传导过程中发挥着重要的调节作用。本研究通过使用SHP-1和Src的抑制剂,发现SHP-1和Src对THP-1巨噬细胞中TLR2和TLR4介导的JNK激活及IL-12产生有重要的正调控作用,进一步研究发现HBsAg可以显著抑制Src的激活,提示HBsAg进入细胞后可能通过影响SHP-1/Src从而抑制TLR2和TLR4介导的信号通路激活及细胞因子的产生。综上所述,本研究发现HBsAg对TLR2介导的IL-12产生具有选择性抑制的作用,而对TLR4介导的细胞因子产生及信号通路的激活则具有普遍性抑制作用；在THP-1巨噬细胞、人巨噬细胞及慢性HBV感染患者临床标本等多个层面上,本研究证实HBsAg可以对JNK激活及IL-12产生的抑制。此外,本研究还进一步提出了HBsAg通过进入细胞并影响SHP-1/Src进而抑制TLR2和TLR4信号通路激活及细胞因子产生的可能机制。上述研究有利于丰富人们对病毒拮抗细胞内信号传导机制的认识,也为开发新型抗HBV治疗药物提供了新的理论和实验依据。
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R373.21
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
前言
材料与方法
结果
讨论
结论
创新点
参考文献
文献综述
    参考文献
附录1 H7N9感染患者细胞因子表达水平的研究
附录2
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本文编号：2864991