肝癌大鼠模型的建立及其p53、p21、CyclinD1和STAT3基因表达的研究

发布时间：2020-11-07 11:24

　　 目的 建立DEN诱发性肝癌动物模型，不同时间点（11、15及20周末）观察大鼠癌变过程中组织形态变化；并检测P53、P21、STAT3和CyclinD1在DEN诱发肝癌大鼠组织中基因mRNA转录和蛋白质表达水平，探讨P53、P21、CyclinD1和STAT3在肝癌发生、发展中的作用及可能的机制。 方法 1.将60只大鼠随机分为肝癌模型组（36只）和对照组（24）；肝癌模型组自由饮用用灭菌蒸馏水配置的DEN（0.1mg/mL）溶液，对照组饮用灭菌的蒸馏水，连续饮用20周，各组在11周和15周各处死6只，到20周处死所有大鼠； 2.采用光学显微镜观察模型建立第11、15及20周末等不同时间点肝脏组织形态结构的变化； 3.采用逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）法检测DEN诱发肝癌模型组肝脏p53，P21，CyclinD1和STAT3基因mRNA转录水平； 4.采用蛋白质印迹法（western blotting）检测DEN诱发肝癌模型组肝脏组织中p53，P21，CyclinD1和STAT3蛋白表达水平； 5.采用免疫组织化学SP法进一步检测正常组和DEN诱发肝癌模型组大鼠中p53，P21，CyclinD1和STAT3蛋白表达水平和细胞中表达位置； 6.应用SPSS17.0统计软件处理数据结果并进行独立样本t检验，相关性分析采用Spearman相关分析（Spearman correlation coefficients test)，P0.05表示有显著性差异，P0.01表示有极显著性差异，均有统计学意义。 结果 1.肝脏组织大体观察结果显示，随着DEN诱发肝癌时间的延长，组织表面开始粗糙、颜色变暗、质地较硬、边缘变钝，到20周时组织表面出现大小不一的灰白色病灶。组织形态变化结果显示，随着时间的推移，肝脏组织经过损伤、增生、肝硬化，到20周时3例为肝硬化，8例为肝癌； 2. RT-PCR数据用各指标和β肌动蛋白（β-actin）琼脂糖电泳条带灰度值的平均值的比值来表示，肝癌模型组P53基因转录水平为0.87±0.03，与正常组（0.39±0.03）相比明显高（p0.01）；肝癌模型组P21基因mRNA表达量（0.51±0.05）高于正常组（0.69±0.02），差异有统计学意义（p0.05）；肝癌模型组STAT3基因mRNA表达量（0.31±0.02），与正常组（0.05±0.008）相比明显增高（p0.01）；CyclinD1mRNA的表达量（0.79±0.02）与正常组相比（0.66±0.03）也显著升高（p0.05）； 3. Western blot数据用各指标和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH）条带灰度值的平均值的比值来表示，P53和在肝癌模型组中条带强度的比值平均值(0.45±0.16)，与正常组（0.2±0.09）相比明显高（p0.01）；肝癌模型组P21蛋白表达量（0.91±0.19）也升高，与正常组（0.51±0.14）比较有显著差异（p0.01）；肝癌模型组STAT3蛋白表达量（0.58±0.08），与正常组STAT3蛋白表达量（0.37±0.09）相比有显著性差异（p0.05）；肝癌模型组CyclinD1蛋白表达量（0.65±0.1）明显高于正常组（0.42±0.11）（p0.05）； 4.免疫组织化学结果显示，肝癌动物模型组织中P53、P21、STAT3和CyclinD1蛋白阳性表达率分别为73%、64%、73%和55%，肝癌动物模型组和正常组的平均光密度和值P53分别为404.22±32.98和73.01±6.2、P21分别为279±22.51和6.81±2.03、STAT3分别为4878±55.08和2373±58.8、CyclinD1分别为668.4±23.09和138.86±31.49，各指标在肝癌动物模型组蛋白表达水平与正常组相比差异有统计学意义（p0.01）； 5.各指标蛋白阳性表达率相关性分析结果显示，P53与P21没有相关性（p0.05），P53与CyclinD1、STAT3与CyclinD1正相关（p0.05），P53与STAT3、P21与CyclinD1、STAT3负相关（p0.05）。 结论 肝癌模型大鼠组肝脏组织中P53、P21、STAT3和CyclinD1基因表达水平上调，提示可能P53、P21、STAT3和CyclinD1基因表达水平的改变及其相互作用在DEN诱导的大鼠肝癌模型中促进肝癌的发生、发展。
【学位单位】：新疆大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R735.7;R-332
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
第二章 DEN诱发性肝癌动物模型的建立及其肝脏组织形态变化
    2.1 实验材料与仪器
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 主要试剂和器材
        2.1.3 实验仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 动物模型的建立
        2.2.2 组织病理苏木素-伊红（Hematoxylin and Eosin HE ）染色
    2.3 实验结果
        2.3.1 大鼠肝脏大体观察结果
        2.3.2 组织形态学病理变化
    2.4 讨论
第三章 P53、P21、CYCLIND1 和 STAT3 基因及其蛋白表达水平
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验材料和试剂
        3.1.2 实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 RT-PCR 法检测 P53、P21、STAT3 和 CyclinD1 等基因 mRNA 水平
        3.2.2 western blot 法检测 P53、P21、STAT3 和 CyclinD1 蛋白表达水平
        3.2.3 免疫组织化学法检测 P53、P21、STAT3 和 CyclinD1 蛋白表达水平
    3.3 统计方法
    3.4 实验结果与分析
        3.4.1 肝癌动物模型大鼠肝脏组织中 P53、P21、STAT3 和 CyclinD1 基因 mRNA 转录情况
        3.4.2 肝癌动物模型大鼠肝脏组织中 P53、P21、STAT3 和 CyclinD1 蛋白表达情况（Westernblot 检测结果）
        3.4.3 肝癌动物模型大鼠肝脏组织中 P53、P21、STAT3 和 CyclinD1 蛋白表达情况（免疫组织化学检测结果）
        3.4.4 肝癌动物模型大鼠肝脏组织中 P53、P21、STAT3 和 CyclinD1 蛋白表达水平相关性
    3.5 讨论
第四章 全文总结和展望
    4.1 全文总结
    4.2 本实验研究问题
参考文献
附录1
附录2
在读期间发表论文清单
致谢

【参考文献】

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本文编号：2873876