小窝蛋白-1重组慢病毒载体的构建及鉴定
发布时间：2021-01-09 20:17
目的构建小窝蛋白-1（Cav-1）重组慢病毒载体,并在293T细胞和小鼠中验证Cav-1过表达。方法将Cav-1基因克隆至慢病毒载体GV287,然后利用酶切、PCR扩增鉴定、阳性克隆鉴定及测序验证构建Cav-1重组慢病毒。将Cav-1重组慢病毒转染至293T细胞,通过荧光检测慢病毒转染效果,采用Western blot法检测Cav-1蛋白表达情况,同时转染C57BL6小鼠,免疫组化法检测小鼠肺组织中Cav-1的表达情况。结果经酶切、PCR扩增鉴定以及阳性克隆测序,提示Cav-1重组慢病毒构建正确。荧光检测显示转染Cav-1重组慢病毒后的293T细胞可见强荧光,Western blot法检测结果显示目的基因可表达,小鼠肺组织中Cav-1呈强阳性表达,且实时定量PCR检测Cav-1重组慢病毒滴度为1.3×1012copies/ml,达到可利用标准。结论采用本研究方法可成功构建Cav-1重组慢病毒载体。
【文章来源】：浙江医学. 2019,41(14)
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
目的载体酶切电泳图（1：10kbMarker；2：载体酶切电泳；3：未酶切载体电泳）
fu/鼠浓度的Cav-1空载体病毒经鼻腔滴注至肺内，对肺组织中的支气管平滑肌细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞进行转染；1×108pfu/鼠组、5×108pfu/鼠组和10×108pfu/鼠组分别采用1×108pfu/鼠、5×108pfu/鼠、10×108pfu/鼠3个梯度的重组慢病毒Cav-1经鼻腔滴注至肺内进行转染，3d后采用免疫组化法检测肺组织中Cav-1的表达情况。2结果2.1目的载体酶切结果以及目的基因获取慢病毒载体经BamHI酶切电泳后，为6kb左右的载体片段（图1）。目的基因Cav-1（NM_007616）经PCR扩增后获得580bp的片段（图2）。图1目的载体酶切电泳图（1：10kbMarker；2：载体酶切电泳；3：未酶切载体电泳）１２３10kb8kb6kb5kb4kb3.5kb3kb2.5kb2kb1.5kb1kb750bp500bp１２5kb3kb2kb1.5kb1kb750bp500bp250bp100bp图2目的基因Cav-1PCR产物电泳图（1：Mar-ker；2：Cav-1产物）·1478·
采用乙醚麻醉，固定头部使鼻腔垂直向上。阴性对照组用1×108pfu/鼠浓度的Cav-1空载体病毒经鼻腔滴注至肺内，对肺组织中的支气管平滑肌细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞进行转染；1×108pfu/鼠组、5×108pfu/鼠组和10×108pfu/鼠组分别采用1×108pfu/鼠、5×108pfu/鼠、10×108pfu/鼠3个梯度的重组慢病毒Cav-1经鼻腔滴注至肺内进行转染，3d后采用免疫组化法检测肺组织中Cav-1的表达情况。2结果2.1目的载体酶切结果以及目的基因获取慢病毒载体经BamHI酶切电泳后，为6kb左右的载体片段（图1）。目的基因Cav-1（NM_007616）经PCR扩增后获得580bp的片段（图2）。图1目的载体酶切电泳图（1：10kbMarker；2：载体酶切电泳；3：未酶切载体电泳）１２３10kb8kb6kb5kb4kb3.5kb3kb2.5kb2kb1.5kb1kb750bp500bp１２5kb3kb2kb1.5kb1kb750bp500bp250bp100bp图2目的基因Cav-1PCR产物电泳图（1：Mar-ker；2：Cav-1产物）·1478·
【参考文献】：
期刊论文
[1]芪冬活血饮对急性肺损伤大鼠Cav-1/NF-κB炎性反应信号通路的影响[J]. 洪辉华,杨珺超,蔡宛如. 中华中医药杂志. 2016(01)
[2]小窝蛋白-1在急性肺损伤中的作用研究进展[J]. 谢曼洁,王德明. 现代医药卫生. 2012(15)
[3]小窝蛋白-1的生物学功能及其急性肺损伤[J]. 高磊,孙耕耘. 临床肺科杂志. 2011(12)
本文编号：2967328
【文章来源】：浙江医学. 2019,41(14)
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
目的载体酶切电泳图（1：10kbMarker；2：载体酶切电泳；3：未酶切载体电泳）
fu/鼠浓度的Cav-1空载体病毒经鼻腔滴注至肺内，对肺组织中的支气管平滑肌细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞进行转染；1×108pfu/鼠组、5×108pfu/鼠组和10×108pfu/鼠组分别采用1×108pfu/鼠、5×108pfu/鼠、10×108pfu/鼠3个梯度的重组慢病毒Cav-1经鼻腔滴注至肺内进行转染，3d后采用免疫组化法检测肺组织中Cav-1的表达情况。2结果2.1目的载体酶切结果以及目的基因获取慢病毒载体经BamHI酶切电泳后，为6kb左右的载体片段（图1）。目的基因Cav-1（NM_007616）经PCR扩增后获得580bp的片段（图2）。图1目的载体酶切电泳图（1：10kbMarker；2：载体酶切电泳；3：未酶切载体电泳）１２３10kb8kb6kb5kb4kb3.5kb3kb2.5kb2kb1.5kb1kb750bp500bp１２5kb3kb2kb1.5kb1kb750bp500bp250bp100bp图2目的基因Cav-1PCR产物电泳图（1：Mar-ker；2：Cav-1产物）·1478·
采用乙醚麻醉，固定头部使鼻腔垂直向上。阴性对照组用1×108pfu/鼠浓度的Cav-1空载体病毒经鼻腔滴注至肺内，对肺组织中的支气管平滑肌细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞进行转染；1×108pfu/鼠组、5×108pfu/鼠组和10×108pfu/鼠组分别采用1×108pfu/鼠、5×108pfu/鼠、10×108pfu/鼠3个梯度的重组慢病毒Cav-1经鼻腔滴注至肺内进行转染，3d后采用免疫组化法检测肺组织中Cav-1的表达情况。2结果2.1目的载体酶切结果以及目的基因获取慢病毒载体经BamHI酶切电泳后，为6kb左右的载体片段（图1）。目的基因Cav-1（NM_007616）经PCR扩增后获得580bp的片段（图2）。图1目的载体酶切电泳图（1：10kbMarker；2：载体酶切电泳；3：未酶切载体电泳）１２３10kb8kb6kb5kb4kb3.5kb3kb2.5kb2kb1.5kb1kb750bp500bp１２5kb3kb2kb1.5kb1kb750bp500bp250bp100bp图2目的基因Cav-1PCR产物电泳图（1：Mar-ker；2：Cav-1产物）·1478·
【参考文献】：
期刊论文
[1]芪冬活血饮对急性肺损伤大鼠Cav-1/NF-κB炎性反应信号通路的影响[J]. 洪辉华,杨珺超,蔡宛如. 中华中医药杂志. 2016(01)
[2]小窝蛋白-1在急性肺损伤中的作用研究进展[J]. 谢曼洁,王德明. 现代医药卫生. 2012(15)
[3]小窝蛋白-1的生物学功能及其急性肺损伤[J]. 高磊,孙耕耘. 临床肺科杂志. 2011(12)
本文编号：2967328
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