人类博卡病毒感染性克隆的构建及体外感染模型的研究

发布时间：2021-04-26 11:30

　　2005年,Allander从患有呼吸道感染疾病的幼儿鼻咽物中鉴定出一种未知的DNA病毒,通过对这一新发现的病毒进行序列分析,发现该病毒基因组序列同博卡病毒属的牛细小病毒（bovine parvovirus, BPV）和犬细小病毒（minute virus of canines, MVC）基因组序列有较高的同源性,因此该病毒被命名为人博卡病毒（Human Bocavirus, HBoV）。随后,其他研究者又分离鉴定出另外三种人博卡病毒基因型,分别为HBoV2,3和4。人博卡病毒是继细小病毒B19之后,第二种能对人类致病的细小病毒,该病毒通常在急性呼吸道感染的儿童患者鼻咽物中检测到,世界范围内均有广泛的流行病学报道,检出率一般介于2-19%。HBoV1易同多种常见的呼吸道病毒共感染,被认为是两岁以下儿童呼吸道病毒感染疾病中,继呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus, RSV）、腺病毒（adenovirus, ADV）和鼻病毒（rhinovirus, RhV）之后,第四种重要的病毒感染源。同其它细小病毒类似,HBoV1是小DNA分子病毒,基因组全... 

【文章来源】：华中师范大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：104 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 引言
    1.2 人类博卡病毒的发现和分类
    1.3 人类博卡病毒流行病学研究
        1.3.1 人博卡病毒在世界范围广泛感染
        1.3.2 人博卡病毒与呼吸道病毒共感染
        1.3.3 人博卡病毒感染的临床症状
    1.4 博卡病毒分子生物学研究进展
        1.4.1 人博卡病毒具有独特的末端结构
        1.4.2 博卡病毒主要基因的功能研究
        1.4.3 博卡病毒感染引起细胞DNA损伤反应
    1.5 ALI培养系统简介
    1.6 研究目的和意义
第二章 人类博卡病毒HBOV1全基因组克隆的构建
    2.1 材料与方法
        2.1.1 载体与菌株
        2.1.2 主要试剂与仪器
        2.1.3 病毒样品获取以及病毒DNA的提取
        2.1.4 PCR扩增
        2.1.5 PCR产物纯化
        2.1.6 pBB载体改造
        2.1.7 克隆鉴定及质粒小提和中提
    2.2 结果
        2.2.1 HBoV1全基因组克隆的构建策略
        2.2.2 HBoV1基因组左侧发夹结构的克隆
        2.2.3 HBoV1基因组右侧发夹结构的克隆
        2.2.4 HBoV1全基因组的克隆
    2.4 讨论
第三章 反向遗传系统生成HBOV1
    3.1 材料与方法
        3.1.1 细胞系
        3.1.2 试剂和仪器
        3.1.3 脂质体介导的转染
        3.1.4 Southern Blot分析
        3.1.5 氯化铯梯度离心及样品收集
        3.1.6 Q-PCR检测
        3.1.7 电镜观察
    3.2 结果
        3.2.1 HBoV1全基因组克隆可在HEK293复制
        3.2.2 HBoV1非结构蛋白影响病毒复制
        3.2.3 氯化铯梯度离心纯化制备HBoV1
        3.2.4 电镜观察HBoV1病毒粒子
    3.3 讨论
第四章 HBOV1感染模型的建立
    4.1 材料与方法
        4.1.1 细胞系和原代细胞
        4.1.2 试剂和仪器
        4.1.3 病毒感染
        4.1.4 Q-PCR
        4.1.5 TEER检测
        4.1.6 间接免疫荧光检测
        4.1.7 组织学分析
        4.1.8 Western Blot检测
    4.2 结果
        4.2.1 HBoV1感染primary HAE
        4.2.2 HBoV1感染primary HAE生成子代病毒
        4.2.3 HBoV1感染破坏primary HAE紧密连接屏障
        4.2.4 HBoV1感染引起primary HAE纤毛脱落
        4.2.5 几种常见呼吸道上皮细胞系不支持HBoV1复制
        4.2.6 HBoV1可感染CuFi-HAE
        4.2.7 HBoV1感染CuFi-HAE导致损伤
    4.3 讨论
第五章 HBOV1在PRIMARY HAE中高效复制
    5.1 材料与方法
        5.1.1 原代细胞
        5.1.2 试剂和仪器
        5.1.3 病毒感染
        5.1.4 Q-PCR
        5.1.5 TEER检测
        5.1.6 间接免疫荧光分析
        5.1.7 组织学分析
    5.2 结果
        5.2.1 HBoV1高效感染primary HAE并产生子代病毒
        5.2.2 极低MOI的HBoV1感染仍可破坏primary HAE
        5.2.3 HBoV1可从ALI下层感染primary HAE
    5.3 讨论
参考文献
附录Ⅰ HBOV1 SALVADOR分离株全序列（JQ923422）
攻读博士学位期间论文发表情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]儿童急性呼吸道博卡病毒感染[J]. 瞿小旺,漆正宇,段招军,刘劲松,刘巧突,刘文培,黄灿平,谢志萍,彭夫望,高寒春,郑丽舒,侯云德.  病毒学报. 2006(02)
[2]粤东地区细支气管炎患儿中人偏肺病毒和人博卡病毒的检出[J]. 林广裕,朱玲,林创兴,吴扬,周仁彬,周晓华,马廉,陆学东.  中华儿科杂志. 2009 (04)



本文编号：3161338