以DNA为基础的复合免疫接种诱导小鼠抗AMA1免疫应答

发布时间：2021-04-26 16:14

　　疟疾仍然是危害人类健康的严重传染病，有效的疫苗将为防止疟原虫感染、减少疟疾发病和阻断蚊媒传播提供重要的手段。DNA疫苗是一种全新的疫苗形式，具有简单、稳定和灵活多样的突出特点，可诱导包括细胞和抗体在内的多种免疫应答。细胞因子在免疫应答过程中具有重要的作用，编码细胞因子的质粒DNA可有效促进和调节DNA疫苗所诱导的免疫应答。用DNA进行初始免疫，用重组蛋白或重组减毒痘病毒进行追加免疫的初始／强化免疫方案可选择性地增强由DNA免疫所诱导的免疫应答，提高DNA疫苗的保护效能。AMA1是红内期疟疾疫苗的重要候选抗原，抗体在针对AMA1的保护性免疫中发挥着关键作用。本研究选择AMA1的胞外域片段作为疫苗靶向，制备了包括重组蛋白、质粒DNA和重组MVA在内的三种不同形式的原型疫苗，在分析各种疫苗免疫特性的基础上，采用DNA加细胞因子编码质粒进行初始免疫，用重组蛋白和重组MVA按不同的顺序进行追加强化，探讨了不同免疫方案在增强小鼠抗AMA1抗体应答中的作用。 首先，自P.f基因组DNA中扩增出编码AMA1胞外域的基因片段，经测序确证后，克隆入原核表达载体。构建了可分别表达AMA1完整胞外域蛋白... 

【文章来源】：中国人民解放军空军军医大学陕西省 211工程院校

【文章页数】：96 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
目录
英文缩写词注
摘要
前言
研究内容
    第一部分 重组AMA1蛋白的制备及其诱导的小鼠抗体应答
        一 材料与方法
            1 疟原虫的培养和基因组DNA的提取
            2 引物设计和PCR
            3 重组表达载体的构建和序列测定
            4 质粒和菌种
            5 重组表达产物的溶解性实验
            6 包涵体蛋白的纯化
            7 变性蛋白的重折叠复性
            8 小鼠免疫和抗体的检测
            9 IFA和Western blot
            10 免疫血清的体外抑制实验
        二 结果
            1 AMA1胞外域编码基因的扩增和序列分析
            2 重组AMA1蛋白的表达和纯化
            3 小鼠免疫血清的制备以及体外抑制实验
        三 讨论
    第二部分 细胞因子质粒对AMA1 DNA免疫的调节作用
        一 材料与方法
            1 AMA1 DNA免疫质粒的构建
            2 GM-CSF编码序列的测定和表达载体的构建
            3 IL-4编码序列的测定和表达载体的构建
            4 IL-12编码质粒的酶切鉴定
            5 双表达质粒pGM-CSF／pTPA-E的构建
            6 质粒的纯化
            7 AMA1 DNA免疫的抗体动力学分析
            8 细胞因子质粒与VR1020／E的组合免疫
            9 脾细胞增殖实验
        二 结果
            1 AMA1 DNA免疫质粒的构建
            2 小鼠细胞因子编码序列的测定和表达质粒的构建
                2.1 小鼠细胞因子GM-CSF的序列分析和载体构建
                2.2 小鼠细胞因子IL-4的序列测定和载体构建
                2.3 pIL-12的酶切鉴定
                2.4 双表达质粒pGM-CSF／pTPA-E的鉴定
            3 细胞因子对AMA1 DNA免疫的调节作用
                3.1 AMA1 DNA免疫的抗体动力学
                3.2 细胞因子表达质粒对DNA免疫应答的调节作用
                    3.2.1 IgG抗体的水平和类型
                    3.2.2 脾细胞的体外增殖
        三 讨论
    第三部分 表达AMA1的重组MVA的筛选及小鼠免疫
        一 材料与方法
            1 基因转移载体pⅢdHR.ssp/E的构建
            2 AMA1转移载体与MVA的同源重组
            3 重组MVA的筛选
            4 重组MVA的鉴定
            5 重组病毒的扩增和滴度测定
            6 小鼠的免疫
        二 结果
            1 AMA1基因转移载体的构建
            2 表达AMA1的重组MVA的筛选和鉴定
                2.1 MVA重组体的PCR鉴定
                2.2 AMA1在BHK21中的表达
                2.3 重组病毒rMVA/E的稳定性
            3 重组MVA的免疫特性分析
                3.1 rMVA／E诱导小鼠抗AMA1抗体应答
                3.2 rMVA／E免疫小鼠的脾细胞增殖
        三 讨论
    第四部分 以DNA为基础的复合免疫接种诱导小鼠抗AMA1抗体应答
        一 材料与方法
            1 rMVA/E对DNA免疫小鼠抗体应答的增强作用
            2 重组蛋白强化与重组MVA强化的比较以及组合强化免疫
        二 结果
            1 rMVA／E对DNA免疫小鼠抗体应答的增强作用
            2 重组蛋白E与rMVA／E抗体强化作用的比较以及组合强化的效果
        三 讨论
小结
文献回顾
    一 DNA免疫的机制和优化方法
    二 改良的安卡拉痘苗病毒（MVA）及其应用
    三 疟原虫顶端膜抗原1（AMA1）的研究概况
参考文献
致谢
附录: 研究生期间发表的论著



本文编号：3161716