分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknK的功能研究

发布时间：2025-03-20 05:29

　　 【目的】丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶K(Serine/Threonine protein kinases K)是分枝杆菌类似真核样的蛋白激酶,预测在分枝杆菌的生长和新陈代谢等生理过程中起着重要的作用,解析PknK的生物功能及作用机制,将为结核病的防治提供一定的理论基础。【方法】通过基因敲除等遗传方法获得结核分枝杆菌疫苗株BCG的pknK敲除菌株△pknK、回补菌株pMV361-pknK/△pknK和过表达菌株pMV261-pknK/BCG;对获得的菌株进行生长曲线测定和抗药性分析;通过pulldown-MS方法及生物信息学方法鉴定了PknK相互作用蛋白。【结果】监测各种分枝杆菌△pknK、pMV361-pknK/△pknK和pMV261-pknK/BCG生长,确定PknK负调控BCG生长;抗药性分析显示PknK降低BCG的耐药性;pulldown-MS方法显示PknK与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknA和双组分系统中的反应调节因子MtrA、TrcR、MoxR等蛋白相互作用。【结论】研究发现PknK调控分枝杆菌的生长和耐药性,我们的研究为深入研究PknK在结核分枝杆菌中的功能奠定了基础。

【文章页数】：12 页

【部分图文】：

图1.敲除菌株的构建模型及鉴定图谱

以BCG基因组为模板，PCR实验扩增目的基因pknK，引物(表1)为pknK-F和pknK-R。使用限制性内切酶HpaI和HindIII对扩增产物和载体pMV361进行酶切，并连接酶切产物，转化DH5α感受态细胞，LB培养基(卡那霉素50mg/L)培养。挑选单菌落进行基因测....

图2.PknK负调控BCG的生长

获得敲除菌株△pknK后，我们首先检测了PknK对细菌的生长是否有影响。△pknK和BCG接种于7H9培养基中培养，每12h取样测定OD600值。在前期48h，△pknK生长比BCG稍微有生长优势；在后期，与野生型BCG比，敲除菌株△pknK有明显的生长优势；回补菌株pMV3....

图3.PknK降低BCG的耐药性

为了进一步了解PknK的生物功能，我们利用pulldown-MS的方法筛选与PknK蛋白相互作用的候选蛋白(图4-A)。为了获得直接与PknK相互作用的蛋白，我们在大肠杆菌中表达了PknK蛋白，与Ni-NTABeads孵育，用磷酸盐缓冲液冲洗获得Ni-NTAbeads-Pkn....

图4.Pulldown-MS方法鉴定PknK互作蛋白

图3.PknK降低BCG的耐药性在质谱分析筛选出的靶标蛋白中，我们挑选了PknA与PknK进行了体外pulldown实验验证。首先，我们构建了PknA的表达质粒pGEX-5x-pknA，并转化得到表达菌株。纯化的GST-PknA与PknK-His混合孵育，用GST-tag进行p....

本文编号：4037456