登革病毒2型外膜E蛋白基因DⅢ区的表达及其在血清学诊断方面的应用研究

发布时间：2017-06-02 16:10

  本文关键词：登革病毒2型外膜E蛋白基因DⅢ区的表达及其在血清学诊断方面的应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：最近几十年来，由于全球人口数量和流动性持续增加，登革热在全球的流行范围不断扩大，并已成为目前世界上分布最广、发病最多的虫媒病毒病，对人类健康造成严重的威胁。由于缺乏疫苗，登革热的防治一直是世界性难题。除了媒介控制外，感染者的及时发现、隔离以及治疗是目前预防登革热进一步扩散的重要手段，因此，早期诊断对于登革热的预防控制至关重要。 登革热的早期诊断一直是登革热防治研究领域的热点，相关的实验诊断技术也在不断发展，包括病毒核酸检测、抗原抗体检测在内的多种实验诊断技术已被应用于常规的实验检测工作。目前，国外已经有多家试剂公司研制成功并推出了包括酶联免疫吸附法（ELISA）、胶体金免疫层析法（ICT）等在内的商品化病毒抗体检测试剂盒，此类试剂盒具有快速、操作简便等特点，为大多数实验室，特别是基层实验室所采用。近年来，国内虽然也有不少研究机构开展登革病毒抗体检测试剂盒的研制，并有相关研制的报道，但其实际应用一直没有取得突破，试剂的国产化一直是国内登革热防控工作的短板。 本课题以登革2型病毒外膜蛋白（envelope，E）为研究对象，，在其编码基因的DⅢ区上下游各设计8条引物，分别引入Nde I和Xho I两个酶切位点，交叉配对共扩增出64条DⅢ区基因片段，利用pET30a(+)表达系统在大肠杆菌BL21（DE3）中分别克隆和表达，经SDS-PAGE和Western blot验证其表达含量及重组蛋白的免疫反应性，筛选表达量大且有较强免疫反应性的重组蛋白抗原进行纯化并建立间接ELISA法用以检测登革热IgM抗体，为国产试剂提供候选抗原和方法。 为评价实验建立的ELISA法检测效果，我们以Panbio公司生产的登革热IgM检测试剂盒作为对照，选取112份临床血清标本进行了初步的试剂评估。检测结果表明，以IFA检测结果为金标准，本研究ELISA法检测IgM的灵敏度为94.64%，特异度为91.07%；与Panbio公司生产试剂盒相比，本研究建立的ELISA法检测登革病毒IgM抗体的检测阳性符合率为92.85%，阴性符合率为89.29%，总符合率为91.07%，Kappa值为0.8214，提示两检测方法具有较高的一致性，且两种检测方法差异无统计学意义（χ~2=0.3,P0.05）。提示本研究所建立的方法具有较好的应用前景。
【关键词】：登革病毒 外膜E蛋白 DⅢ区 免疫反应性 血清学诊断
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 主要英文缩写词9-11
• 第一部分 引言11-13
• 第二部分 材料与方法13-27
• 一、 材料13-15
• 1．病毒株及细胞株13
• 2．血清标本13
• 3．质粒和菌种13
• 4．细胞培养所用试剂13
• 5．分子克隆所用的试剂13-14
• 6．蛋白表达与纯化所用试剂14
• 7．抗体14
• 8．主要仪器和设备14-15
• 9．主要的生物软件及分析工具15
• 二、 方法15-27
• 1． 病毒的增殖及间接免疫荧光法（IFA）验证病毒增殖情况15
• 2． 病毒 RNA 的提取15-16
• 3． Den2 E 基因片段的扩增及 TA 克隆的构建。16-19
• 4． Den2 E 基因 DⅢ区片段的扩增及表达载体的构建19-22
• 5． BL21（DE3）感受态细胞制备22-23
• 6． 重组蛋白的小量诱导表达及免疫反应性检测23-24
• 7． 重组蛋白的大量表达与纯化24-25
• 8． 重组蛋白抗原应用于 ELISA 检测25-26
• 9． IFA 检测临床标本中抗体情况26
• 10． ELISA 结果的统计处理26-27
• 第三部分 结果27-43
• 一、 病毒感染后的细胞形态变化及 IFA 检测结果27-28
• 二、 Den2 全长 E 基因片段的扩增、TA 克隆及序列分析28-29
• 1． Den2 全长 E 基因片段的扩增结果28
• 2． Den2E TA 克隆的酶切鉴定及序列分析28-29
• 三、 E 基因 DⅢ区的扩增及重组质粒的构建29-32
• 1． Den2 E 基因 DⅢ区的扩增29-31
• 2． DⅢ区重组表达质粒的酶切鉴定31-32
• 四、 重组质粒的小量诱导表达与免疫反应性鉴定32-34
• 1． 重组质粒的小量诱导表达32-33
• 2． 重组蛋白 Western blot 鉴定免疫反应性。33-34
• 五、 重组蛋白的大量表达与纯化34-37
• 1． 重组蛋白的大量表达及包涵体的洗涤34-35
• 2． 重组蛋白的纯化35-36
• 3． 纯化后重组蛋白的免疫反应性鉴定36-37
• 六、 重组蛋白 F4R1 间接 ELISA 法检测临床血清 IgM 抗体37-43
• 1． 本研究重组蛋白间接 ELISA 法检测临床血清 IgM 抗体结果37-41
• 2． 本研究重组蛋白间接 ELISA 法检测临床血清 IgM 抗体结果的统计分析41-42
• 3． 型别交叉反应42-43
• 第四部分 讨论43-47
• 第五部分 结论47-48
• 参考文献48-50
• 致谢50-51
• 综述51-58
• 参考文献55-58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 田秀君;赵高潮;乌姗娜;谷俊朝;;登革疫苗研究进展[J];中国热带医学;2010年12期

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本文编号：415817