成纤维细胞生长因子-2对成骨细胞矿化的影响及其机制研究

发布时间：2017-06-11 00:01

  本文关键词：成纤维细胞生长因子-2对成骨细胞矿化的影响及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在骨形成过程中，成骨细胞分泌大量的生长因子如成纤维细胞生长因子-2、类胰岛素生长因子-1以及转化生长因子-β等，通过自分泌或旁分泌的方式调控成骨细胞的生长、分化和矿化。其中，成纤维细胞生长因子-2（Fibroblast growth factor-2，FGF2）在成骨以及骨枷形成中发挥重要的作用。研究表明，，FGF2对成骨细胞分化和矿化的影响是分阶段性的；并且FGF2长期作用于成骨细胞可明显抑制其矿化。研究表明FGF2可通过改变PPi/Pi调控蛋白的表达抑制成骨细胞的矿化，但是FGF2影响成骨细胞矿化的机制仍不清楚，尤其是其胞外机制的研究还尚未报道。 基质小泡（Matrix Vesicles，MVs）是一类直径为30-400nm的、由膜包被的小囊泡，通过出芽的方式由具有矿化能力的细胞如成骨细胞、软骨细胞等分泌到细胞外基质中；MVs通过其富含的多种功能蛋白质在细胞外基质中吸收钙离子和磷离子,形成羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）,羟基磷灰石在MVs中继续生长，直至刺破MVs膜，定位于胶原上，启动矿化。除了在生理性矿化中的重要作用外，MVs在病理性矿化类疾病的发生和发展中也起着非常重要的作用；如MVs的功能增强是动脉粥样硬化发生的重要病理机制。尽管MVs在矿化过程中起重要作用，但是目前对MVs功能的调控机制仍知之甚少。 目的：本研究旨在探究FGF2对成骨细胞矿化的影响，并对其胞外机制进行研究。 方法：（1）采用含有抗坏血酸和β-磷酸甘油的矿化诱导液促进Saos-2细胞成骨分化及矿化，建立细胞矿化模型。（2）将Saos-2细胞分为正常对照组、矿化诱导组和FGF2组，矿化诱导组在培养液中加入50ug/ml抗坏血酸和7.5mMβ-磷酸甘油的诱导培养液50ng/ml的FGF2进行培养。三组细胞在培养第3、6、9天分别进行矿化相关基因ALP, Runx2和ColIa1的表达量检测，并进行矿化结节定性、定量检测。（3）用ExoQuickTM试剂方法提取正常对照组、矿化诱导组和FGF2组Saos-2细胞的细胞外分泌物。然后，用电子显微镜检测分泌物形态，用western blot的方法检测基质小泡表面标志物CD63和CD9的表达情况。（4）用p-NPP检测基质小泡的ALP活性，然后将提取后的MVs在矿化缓冲溶液（SCL）中孵育12h, MVs可继续吸收钙离子形成羟基磷灰石。钙离子检测试剂盒检测三组MVs孵育完之后的钙离子浓度，以检测MVs的体外矿化能力。 结果：（1）茜素红染色结果显示矿化诱导组发生明显矿化，产生大量矿化结节，对照组只有少量矿化；矿化结节定量结果显示诱导组产生的矿化结节是正常对照组的5倍左右，说明我们成功构建了Saos-2的体外矿化模型。（2）FGF2明显抑制了Saos-2细胞矿化标志标志基因ALP, Runx2和CoIa1的表达，并且减弱了细胞的矿化；证明FGF2对Saos-2细胞的成骨分化和矿化具有明显的抑制作用。（3）电镜观察发现采用ExoQuickTM试剂提取三组Saos-2细胞分泌物直径均在30-400nm之间，为膜包被小泡；Western Blot结果检测发现三组小泡均表达基质小泡标志蛋白CD63和CD9，成功提取了基质小泡。（4）ALP活性分析显示，FGF2组的ALP活性低于矿化诱导组；各组MVs孵育之后，钙离子浓度测定显示，FGF2组钙离子浓度明显低于矿化诱导组，FGF2明显抑制了基质小泡体外矿化能力。 结论：成纤维细胞生长因子-2长期作用于Saos-2细胞可明显抑制其矿化，并可通过抑制基质小泡的功能发挥其抑制作用。
【关键词】：成纤维细胞生长因子-2 Saos-2细胞 矿化 基质小泡
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 主要符号表13-14
• 前言14-19
• 1 成骨细胞矿化14-15
• 1.1 概述14
• 1.2 生长因子与成骨细胞矿化14-15
• 2 成纤维细胞生长因子-215-16
• 2.1 概述15
• 2.2 FGF2 与成骨细胞矿化15-16
• 3 基质小泡16-19
• 3.1 基质小泡定义16-17
• 3.2 基质小泡介导的矿化机制17
• 3.3 基质小泡功能蛋白质17-18
• 3.4 生长因子与基质小泡18-19
• 第一章 Saos-2 细胞矿化诱导模型的建立19-24
• 1 材料与方法19-22
• 1.1 材料19-20
• 1.2 方法20-22
• 2 结果22
• 3 讨论22-24
• 第二章 FGF2 对 Saos-2 细胞矿化的影响24-31
• 1 材料与方法24-29
• 1.1 材料24-25
• 1.2 方法25-29
• 2 结果29-30
• 3 讨论30-31
• 第三章 基质小泡的提取和验证31-38
• 1 材料与方法31-36
• 1.1 材料31-33
• 1.2 方法33-36
• 2 结果36-37
• 3 讨论37-38
• 第四章 基质小泡功能分析38-45
• 1 材料与方法38-42
• 1.1 材料38-40
• 1.2 方法40-42
• 2 结果42-43
• 3 讨论43-45
• 参考文献45-52
• 附录52-54
• 综述54-73
• Reference67-73
• 在校期间发表论文73-74
• 致谢74

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