耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床分离株的分子分型及耐药性分析

发布时间：2017-06-11 01:06

  本文关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床分离株的分子分型及耐药性分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是院内感染的主要病原菌之一，也是社区中引起皮肤和软组织感染的常见原因。1961年Jevons在英国发现首例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)感染后，MRSA便以惊人的速度在世界范围内蔓延，20世纪70年代后期已遍布世界各个角落，80年代末成为全球性病原微生物。在世界各地，曾多次出现医院内MRSA感染的暴发和流行，且一旦发生，往往迅速传播，较难控制，导致发病率及病死率居高不下，给医院和社会带来沉重的负担。 MRSA是医院感染的重要病原菌，在医院获得感染的MRSA被称为医院获得性MRSA(hospital-acquired MRSA，HA-MRSA)，通常通过接触传播，感染年龄较大、免疫力低下、皮肤有伤口或于体外有管道相通的患者，健康人很少受到感染。然而近年来的研究显示，一种新型的MRSA引起感染的比例呈逐年上升趋势，这种新近流行的MRSA最早发现于1997年的美国纽约，其后多发生于社区环境中，通常感染无相关危险因素的健康群体，被称为社区获得性MRSA(community-acquired MRSA，CA-MRSA)。 MRSA是金葡菌获得了具有高度多态性的外源性葡萄球菌染色体盒(staphylococcalcassette chromosome mec，SCCmec)后形成的，HA-MRSA多携带I、II、III型SCCmec移动元件，这几型元件较大，可携带多种耐药基因，临床上表现为多重耐药。相对而言，IV和V型SCCmec元件多在CA-MRSA菌株之间传播，元件片段较小，除mecA基因外较少携带其他耐药基因。 目前，在全球范围内，HA-MRSA主要由一些具有特定遗传背景的克隆组成。在欧洲，德国、比利时主要为Iberian和Southern Germany克隆，英国为EMRSA-16克隆。在亚洲，韩国、日本主要为New York/Japan克隆，而在印度及我国台湾等地主要为Brazilian/Hungarian克隆流行。CA-MRSA同样存在一些主要的克隆。USA300是在世界范围内，尤其是在美国流行最为广泛的克隆，荷兰主要为USA1000和USA300克隆，英国主要为EMRSA-15克隆，韩国以USA700克隆为主，我国香港主要为USA1100和USAl000克隆。这些情况表明MRSA的流行具有地理上的独特性。 控制MRSA流行的重要策略在于明确其流行环节、切断传播途径、终止耐药菌株在人群中的传播。因而，检测MRSA流行株的分子特征及耐药谱对于鉴别菌株间的亲缘关系、有效控制MRSA感染意义重大。本研究对2009年2月至2012年5月从北京、上海、重庆、广州、沈阳、乌鲁木齐等6座城市的9所教学医院收集的517株金黄色葡萄球菌进行检测研究，鉴定出MRSA菌株，再综合运用MRSA分子分型方法，对所有MRSA菌株进行分型分析。所得结果不仅可以丰富我国MRSA的分子流行病学资料，为MRSA感染的监控提供实验依据，并为我国其他地区MRSA感染和流行的检测提供借鉴。同时对MRSA菌株的抗生素耐药谱进行测定和分析，探讨耐药谱与菌株分子分型之间的关系，为研究MRSA的耐药机制提供依据，进一步对指导临床抗生素的合理应用，减少抗生素的浪费，从根本上控制MRSA的感染和暴发流行有重要意义。主要研究内容和结果包括以下三个部分： 1. MRSA的分子鉴定：应用mecA-femB双重PCR确认MRSA。检出MRSA309株，检出率59.8%（309/517）。 2. MRSA分子分型研究：①SCCmec基因分型：用PCR方法扩增mec复合物及ccr复合物各基因组分，产物经电泳成像后判断其片段大小和组成，明确SCCmec基因型。结果309株MRSA菌株中SCCmec III型178株、占57.6%，SCCmec II型68株、占22.0%，SCCmec IV型27株、占8.7%，SCCmec I型19株、占6.2%，SCCmec V型13株、占4.2%，未分型MRSA4株、占1.3%；②葡萄球菌A蛋白基因多态性分析(spa)：PCR方法扩增葡萄球菌的表面蛋白SPA基因的X区，并进行核苷酸测序，将测序结果与数据库(http://www.ridom.de/spaserver)中公布的碱基重复序列进行比较，根据排列方式及重复次数确定MRSA的spa型别。结果309株MRSA菌可分为31个spa基因型，其中优势型别为t030型（90株，占29.1%）、t002型(49株,占15.9%)、t037型（48株，15.5%），另外发现新的spa基因型7株；③多位点序列分型(MLST)：以金葡菌的7个管家基因(arc,aroE, glpF, gmk, pta, tpi and yqiL)的PCR扩增片段序列分析为基础，产物经纯化后进行双向测序，直接将结果提交数据库(http://saureus.mlst.net/)进行比较，比较每个多态性位点的等位基因，获得序列号(ST)，与已知的MRSA流行株进行比较和分析。309株MRSA菌可分为15个ST型，优势型别为ST239型(159株，，51.5%）、ST5型(78株,占25.2%)、ST59型(33株，10.7%)，另外发现新的ST型4株；④脉冲场凝胶电泳分型(PFGE)：新鲜培养的MRSA包埋于琼脂中，经过破壁、原位消化、酶切、电泳、染色和紫外成像后，所得结果用软件BioNumerics version6.6(Applied Maths)进行聚类分析。结果309株MRSA分为23个聚类组，依次命名为A-W型。包括17个大聚类组、6个小聚类组以及37个偶发株。其中E型、I型、L型和M型为主要型别，分别占9.7%(30/309)、10.0%(31/309)、12.9%(40/309)和7.8%(24/309)；⑤杀白细胞毒素(PVL)毒力基因检测：PCR方法扩增特征基因。76株MRSA扩增条带显示pvl基因阳性，阳性率为24.6%。 3. MRSA的药敏试验：采用BioFosun微生物鉴定药敏分析仪检测MRSA对17种抗生素的敏感性。结果显示对β-内酰胺类抗生素的耐药率最高，如对苯唑西林的耐药率为97.6%，对青霉素的耐药率为100%，对氨苄西林的耐药率为99.4%。同时，对多种非β-内酰胺类抗生素也有较高的耐药率，如对庆大霉素的耐药率为77.3%，对环丙沙星的耐药率为80.2%，对克林霉素的耐药率为80.9%，对红霉素的耐药率为86.2%以及对左氧氟沙星的耐药率为81.7%。如果将某一菌株对3种以上非β-内酰胺类抗生素耐药定义为多重耐药菌株，则检测的结果显示74.8%(231/309)的MRSA株是多重耐药菌株。 综上所述，分子流行病学检测显示我国MRSA并非以单一克隆占优势，主要由3种克隆(ST239-MRSA-III-t030、ST5-MRSA-II-t002和ST239-MRSA-III-t037)构成，并且呈交替流行趋势。除了上述流行优势克隆外，另外发现6个小规模的克隆在中国局部地区流行，如在重庆流行的ST239-MRSA-III-t138(3.6%,11/309)，在广州流行的ST45-MRSA-III-t1081(3.6%,11/309)和ST59-MRSA-I-t437(2.6%,8/309)，主要在沈阳流行的ST5-MRSA-II-t570(46.4%,13/28)，以及在重庆和广州流行的ST59-MRSA-IV-t437(3.6%,11/309)和ST59-MRSA-V-t437(1.6%,5/309)。本研究结果同时提示不同地区的MRSA优势流行克隆对抗生素的耐药谱(定义耐药率大于70%的非β-内酰胺类抗生素组成不同型别MRSA耐药谱)不尽相同，北京、广州和乌鲁木齐流行的ST239-MRSA-III-t030克隆有耐药谱GEN/CIP/RIF/LVX，重庆的流行克隆ST239-MRSA-III-t037和上海的流行克隆ST5-MRSA-II-t002有相同的耐药谱GEN/CIP/CLI/ERY/TET/LVX/SXT，沈阳的流行克隆ST5-MRSA-II-t570有耐药谱GEN/CIP/CLI/ERY/TET/LVX。MRSA流行的地理特性和对抗生素的多重耐药提示对MRSA长期的进化和耐药问题需要进行长期的多中心联合的动态研究，以便为MRSA的防控提供重要参考依据。
【关键词】：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 分子分型 药敏试验 耐药谱
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.11;R446.5
【目录】：

• 缩略语表4-7
• Abstract7-11
• 摘要11-14
• 第一章 前言14-19
• 1.1 选题缘由14
• 1.2 研究背景14-16
• 1.3 研究意义16-17
• 1.4 研究内容17
• 1.5 研究方法17-19
• 第二章 金葡菌临床分离株的收集、培养及 MRSA 的鉴定19-27
• 2.1 材料与方法19-24
• 2.2 结果24-25
• 2.3 讨论25-27
• 第三章 MRSA 的分子分型27-52
• 3.1 材料与方法27-39
• 3.2 结果39-46
• 3.3 讨论46-52
• 第四章 MRSA 临床分离株的耐药性分析52-59
• 4.1 材料和方法53-54
• 4.2 结果54-56
• 4.3 讨论56-59
• 全文总结59-61
• 参考文献61-68
• 文献综述68-79
• 参考文献77-79
• 攻读学位期间的研究成果与参与的课题79-80
• 致谢80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李家泰,AllanJ Weinstein,杨敏,中国细菌耐药监测研究组;中国细菌耐药监测研究[J];中华医学杂志;2001年01期

  本文关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床分离株的分子分型及耐药性分析，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：440410