LSDP5在小鼠肝脏脂毒性损伤中的作用与初步机制研究

发布时间：2017-06-11 01:07

  本文关键词：LSDP5在小鼠肝脏脂毒性损伤中的作用与初步机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目前研究认为，非酒精性脂肪性肝炎（NASH）发生的核心机制是脂毒性（Lipotoxicity）损伤，其中非酯化脂肪酸（NEFA）及其相关产物的代谢异常，是诱发脂毒性损伤的重要原因，而细胞内脂肪酸主要以甘油三酯（TG）的形式储存在脂滴（LD）中，因此脂滴的代谢异常与肝脏脂毒性损伤有着密切的关系。目前，脂滴被认为是一个代谢活跃的“细胞器”，在脂质储存和代谢过程中具有重要的作用，而脂滴表面相关蛋白是调节脂滴代谢的重要分子。其中，PAT家族蛋白是一组最为重要的脂滴表面相关蛋白，LSDP5是PAT家族的第5个成员，主要分布在高氧化代谢的组织中，如肝脏、心肌、骨骼肌和BAT，又被称为Perilipin5、OXPAT，或MLDP。然而，LSDP5在肝脏的具体生理学功能和作用机制尚不清楚。 本研究主要利用建立的LSDP5敲除小鼠模型，通过研究LSDP5敲除小鼠的主要表型变化，肝脏形态学与生理学功能的变化，以及LSDP5缺失对肝脏脂滴和线粒体相关分子表达水平的影响，最终阐明LSDP5在肝脏脂毒性损伤中的作用与初步分子机制。本研究结果不仅能够使我们更加深刻地理解脂滴代谢过程与肝脏脂毒性损伤之间的关系，同时对脂肪肝、NASH等疾病的临床诊治也具有重要的意义。 1、LSDP5敲除小鼠表现出肝脏损伤。 通过分析LSDP5敲除小鼠生长繁殖状况和基因型，我们没有发现LSDP5敲除小鼠的生长和繁殖过程出现变化。同时，LSDP5敲除小鼠的体重、胰岛素敏感性（GTT和ITT）和主要器官重量也未出现明显变化。另外，我们发现，正常饮食和高脂饮食的LSDP5敲除小鼠，其血糖、血脂、血清总蛋白、白蛋白也未见明显变化。然而，血液生化分析结果显示，LSDP5敲除小鼠血清中ALT、AST、DB、TB均明显升高。因此我们认为，LSDP5缺失能够造成小鼠肝脏的损伤。 2、LSDP5敲除小鼠肝脏内脂肪含量降低，且线粒体出现增殖。 为了明确LSDP5敲除小鼠肝脏损伤的主要表现，我们利用组织学研究方法，分析了LSDP5敲除小鼠肝脏形态的变化。HE染色结果显示LSDP5敲除小鼠肝脏出现肝板结构紊乱、细胞核大小不一等损伤的表现，且高脂饮食小鼠的肝脏损伤表现更加明显。油红O染色结果显示正常饮食和高脂饮食的LSDP5敲除小鼠肝脏中脂肪含量相对于野生型小鼠均明显降低。同时，体外分离培养的LSDP5缺失肝细胞内脂滴数量减少，体积变小。电镜观察结果显示LSDP5敲除小鼠肝脏中线粒体数量明显增加，但体积相对变小。同时，MitoTracker染色结果也提示体外培养的LSDP5缺失肝细胞内线粒体数量增加。而且，LSDP5敲除小鼠肝脏中线粒体的标志物Cox IV、Cytochrome C表达水平也升高。这些结果表明，LSDP5缺失能够抑制肝细胞内脂质的储积，同时促进线粒体的增殖。 3、LSDP5敲除小鼠肝细胞内脂肪酸氧化速率加快，造成脂质过氧化损伤。 为了确定LSDP5敲除小鼠肝脏中脂肪代谢过程的变化，我们利用3H标记的油酸（Oleic acid-[9,10-3H]）测定了LSDP5敲除小鼠肝细胞的脂肪酸氧化速率、TG合成和分泌速率。结果显示LSDP5缺失肝细胞的脂肪酸β氧化速率加快，TG储存量明显减少，同时肝细胞分泌的TG也减少。进一步，我们发现正常饮食和高脂饮食的LSDP5敲除小鼠肝脏中MDA的水平均明显升高，而抗过氧化的SOD水平降低。通过JC-1染色，我们发现LSDP5缺失肝细胞的线粒体膜电位降低。结合这些结果，我们认为LSDP5敲除小鼠肝脏线粒体数量增加，且脂肪酸氧化速率加快，从而造成肝细胞的脂质过氧化，这可能是LSDP5敲除小鼠肝脏损伤的一个重要原因。 4、LSDP5是一个脂滴表面蛋白，LSDP5敲除小鼠肝脏中PPARα和脂肪酸分解相关分子的表达水平升高，脂肪合成相关分子的表达水平降低。 我们利用细胞器分离技术和GFP融合蛋白进一步确定LSDP5的脂滴定位特性，结果发现LSDP5主要定位于脂滴，但同时也存在于细胞质中。同时确定了N端（1-128aa）是LSDP5脂滴定位的重要结构域。在基因芯片分析的基础上，，我们利用Real-time PCR分析了LSDP5敲除小鼠肝脏中脂肪代谢相关分子的表达水平变化，结果显示LSDP5敲除小鼠肝脏内ADRP表达水平明显降低，而TIP47表达水平升高；同时，线粒体功能相关分子Cox IV、Cytochrome C和CPT1a的表达水平均明显升高，而脂肪合成过程的关键分子ACC1、ACC2、FAS等的表达水平均出现不同程度的降低。更重要的是，我们发现LSDP5敲除小鼠肝脏中脂肪代谢的关键调控分子PPARα在mRNA和蛋白质水平均有明显升高。这些结果说明，LSDP5敲除小鼠肝脏中脂肪酸合成过程受到抑制，但分解过程增强，而PPARα表达水平增高可能是造成LSDP5敲除小鼠肝脏脂肪代谢变化的重要调控机制。 本研究利用LSDP5敲除小鼠模型，发现LSDP5缺失能够造成小鼠肝脏的脂毒性损伤。我们认为，作为PAT家族的重要成员，LSDP5主要定位于脂滴表面和细胞质，能够抑制脂滴中TG的水解。LSDP5缺失肝细胞内脂滴的水解速率加快，降低了肝细胞内脂肪储存量，同时增加了肝细胞内NEFA的含量，进而激活PPARα，促进线粒体增殖，使脂肪酸的氧化速率加快，造成肝细胞内产生过量的ROS，从而造成肝脏的脂毒性损伤。基于这些结果，我们将进一步研究LSDP5在脂滴代谢调控过程中的具体作用和分子机制。
【关键词】：LSDP5 肝脏 脂滴 脂毒性 脂肪代谢 非酒精性脂肪性肝炎
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-14
• 文献回顾14-23
• 第一部分 LSDP5 敲除小鼠的鉴定及一般表型分析23-34
• 1 实验材料23-24
• 2 实验方法24-26
• 3 实验结果26-32
• 4 讨论32-34
• 第二部分 LSDP5 敲除小鼠肝脏的形态学研究34-44
• 1 实验材料34-35
• 2 实验方法35-38
• 3 实验结果38-42
• 4 讨论42-44
• 第三部分 LSDP5 敲除小鼠肝脏的生理学研究44-53
• 1 实验材料44-45
• 2 实验方法45-47
• 3 实验结果47-50
• 4 讨论50-53
• 第四部分 LSDP5 敲除小鼠肝脏脂毒性损伤的分子机制研究53-69
• 1 实验材料53-54
• 2 实验方法54-59
• 3 实验结果59-65
• 4 讨论65-69
• 小结69-70
• 参考文献70-75
• 个人简历和研究成果75-77
• 致谢77

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本文编号：440421