乙肝病毒转基因小鼠和多器官障碍综合征模型的评价及药物干预研究

发布时间：2017-06-15 00:00

  本文关键词：乙肝病毒转基因小鼠和多器官障碍综合征模型的评价及药物干预研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乙型肝炎作为一种世界性的传染病，尚无彻底根治的办法。乙肝病毒（HBV）的宿主特异性给乙肝疾病模型的建立带来了很大难度。目前的乙肝动物模型局限性在于所用动物与人类相比在进化上相去甚远，而一般的哺乳动物又很难感染HBV。因此，建立一种稳定可靠的乙肝动物模型对乙肝发生机制的研究和抗乙肝药物的筛选具有重要意义。多器官功能障碍综合征（MODS）作为一种临床致死率较高的疾病，其发病机制尚无定论，目前普遍认为与机体内皮细胞损伤所释放的内毒素导致多个器官功能障碍有关。临床上降低MODS死亡率的手段主要是积极干预各种会引起感染性休克的因素。而许多抗炎保肝天然产物，能有效抑制机体炎症和内毒素产生，缓解器官的病理损伤。 本课题第一部分以HBV转基因小鼠作为研究对象，首先验证转基因小鼠HBV DNA的复制和HBV抗原的表达情况，然后在体外细胞实验抗乙肝研究结果的基础上，以HBV转基因小鼠作为模型，探讨了松果菊苷对HBV复制的影响。第二部分采用颈动脉穿刺放血和尾静脉注射脂多糖两次打击的方法，建立SD大鼠多器官功能障碍综合征模型，并运用该模型探讨了具有抗炎保肝作用的六棱菊提取物（LAE）对实验性多器官障碍综合征的改善作用。 一、HBV转基因小鼠病毒表达特性及松果菊苷抗HBV作用研究 1. HBV转基因小鼠病毒表达特性研究 HBV转基因小鼠源自正常小鼠受精卵经显微注射整合人类HBV全基因组后培育而成。为了评价转基因小鼠体内HBV的复制情况，抽提转基因小鼠肝组织和尾巴组织DNA，采用荧光定量PCR方法扩增检测HBV DNA水平，并采用ELISA方法检测小鼠血清乙肝表面抗原（HBsAg）和E抗原（HBeAg）水平。通过检测血清转氨酶（GOT/GPT）水平和肝组织病理变化，了解转基因小鼠的肝功能状况。结果表明：HBV转基因小鼠肝组织和血清HBV DNA水平在2.0×103~1.0×107copies/ml之间；血清HBsAg和HBeAg呈阳性；转基因小鼠血清GOT和GPT水平明显高于正常小鼠；肝组织病理学检查显示病理学检查显示局部细胞形态和排列出现轻微改变，肝动静脉有扩张趋势，与转氨酶的升高相吻合。上述结果表明，HBV转基因小鼠体内HBV的复制呈活跃状态，能够在一定程度上模拟乙肝患者HBV的复制，可作为抗乙肝药物评价的疾病模型。 2.松果菊苷体内外抗HBV作用研究 松果菊苷对HepG2.2.15细胞HBV表达的影响：以HBV基因转染的HepG2.2.15细胞为模型，研究松果菊苷的体外抗HBV作用。将HepG2.2.15细胞接种于96孔板，每孔加入含不同浓度（100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml和1μg/ml）松果菊苷和阳性药物拉米夫定的DMEM培养基，每种浓度设三个复孔。在37℃下培养3和6天后，采用ELISA法测定HBsAg和HBeAg水平；采用荧光定量PCR法测定HBV DNA水平。结果表明：松果菊苷作用HepG2.2.15细胞6天后，，在50和100μg/ml浓度下能显著抑制HBsAg和HBeAg表达，其最高抑制率分别为42.68%和46.29%；同时对HBV DNA也具有抑制作用。 松果菊苷对HBV转基因小鼠HBV表达的影响：以HBV转基因小鼠为模型，研究松果菊苷的体内抗HBV作用。将40只HBV转基因小鼠随机分为5组：对照组、拉米夫定（50mg/kg）组、大剂量松果菊苷（50mg/kg）组、中剂量松果菊苷（25mg/kg）组和小剂量松果菊苷（12.5mg/kg）组。每天灌胃给药1次，对照组小鼠给予等剂量的生理盐水，连续给药30天。第31天小鼠眼眶取血，分离血清分别检测HBV DNA、HBsAg、HBeAg、GOT和GPT水平；解剖取其肝脏，提取肝组织DNA并测定其HBV DNA水平，同时制作肝组织病理学检查。结果表明：50mg/kg剂量对血清HBV DNA有显著抑制作用,但各剂量对肝组织HBV DNA水平均无显著性影响。 上述结果表明，松果菊苷具有较明显的体内外抗HBV作用。 二、多器官功能障碍综合征（MODS）模型的建立及其药物干预研究 1. MODS大鼠模型的建立 选取雄性SD大鼠，体重在150-180g之间。动物在建模前12小时开始禁食，以3%的戊巴比妥钠1ml/kg体重腹腔注射麻醉；用一次性针筒抽取大鼠颈部动脉窦血液2ml，对大鼠造成失血性休克创伤；放血后用生理盐水3.5ml/kg体重灌胃；再经12小时后，尾静脉注射7ml/kg脂多糖（LPS），造成二次内毒素刺激；然后每天用生理盐水灌胃，连续三天。三天后从未死亡的造模大鼠中挑选符合多器官障碍体征的大鼠，用于后续实验研究。 2.六棱菊提取物（LAE）对MODS的干预作用研究 取MODS大鼠32只，随机分为4组：模型组，LAE大剂量（100mg/kg）组、LAE中剂量（50mg/kg）组和LAE小剂量（25mg/kg）组，试药组以不同剂量的LAE每天灌胃，模型组给予等剂量的生理盐水。连续给药10天后，采取大鼠血液分离血清，测定超氧化物歧化酶（SOD）、B型钠尿肽（BNP）、一氧化氮（NO）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、尿素氮（BUN）、白细胞介素6（IL-6）和内毒素含量。结果显示LAE对炎症相关介质具有显著抑制作用，能有效缓解大鼠体内炎症，减少机体自由基，显著改善心功能和肝功能。说明LAE对MODS具有明显改善作用。 综上所述，本论文研究了HBV转基因小鼠的病毒表达特性，并采用HBV转基因小鼠，证明了松果菊苷的抗HBV作用；同时通过建立的MODS大鼠模型，探讨了LAE对MODS的改善作用。有关HBV转基因小鼠和MODS动物模型的研究为今后研制新型乙肝和MODS治疗药物提供了有力的工具。
【关键词】：乙肝病毒 转基因小鼠 松果菊苷 多器官功能障碍综合症 脂多糖 动物模型 六棱菊提取物
【学位授予单位】：中国计量学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R459.7;R-332
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-9
• Abstract9-19
• 缩略词表19-20
• 1 绪论20-34
• 1.1 乙型肝炎概述20-22
• 1.1.1 乙肝病毒20-21
• 1.1.2 乙肝病毒的致病机制21
• 1.1.3 乙肝的流行病学21-22
• 1.2 抗乙肝药物概述22-28
• 1.2.1 核苷类药物22-24
• 1.2.2 细胞因子类药物24-25
• 1.2.3 抗乙肝天然产物25-28
• 1.3 抗乙肝药物评价模型28-31
• 1.3.1 细胞模型28
• 1.3.2 动物模型28-30
• 1.3.3 HBV 转基因小鼠抗乙肝模型30-31
• 1.4 HBV 转基因小鼠作为抗乙肝模型的运用31-32
• 1.4.1 研究慢性乙肝的发病机制和探索新的治疗手段31-32
• 1.4.2 研究 HBV 感染和 HCC 的关系32
• 1.4.3 抗乙肝药物的筛选和疗效评价32
• 1.5 多器官功能障碍综合征(MODS)32-34
• 2 实验材料34-36
• 2.1 实验动物34
• 2.2 细胞株34
• 2.3 实验药物34
• 2.4 实验试剂34-35
• 2.5 实验主要仪器35-36
• 3 HBV 转基因小鼠病毒表达特性及松果菊苷抗 HBV 作用研究36-59
• 3.1 HBV 转基因小鼠病毒表达特性研究36-47
• 3.1.1 实验方法36-45
• 3.1.2 统计学处理45
• 3.1.3 实验结果45-47
• 3.1.4 讨论47
• 3.2 松果菊苷抗乙肝作用研究47-59
• 3.2.1 松果菊苷对 HepG2.2.15 细胞 HBV 表达的影响48-53
• 3.2.2 松果菊苷对 HBV 转基因小鼠 HBV 表达的影响53-57
• 3.2.3 讨论57-59
• 4 多器官障碍综合征模型建立及运用59-74
• 4.1 多器官功能障碍综合征模型(MODS)的建立59
• 4.2 六棱菊提取物(LAE)对 MODS 的干预作用研究59-72
• 4.2.1 实验方法59-70
• 4.2.2 实验结果70-72
• 4.3 讨论72-74
• 5 小结74-76
• 参考文献76-81
• 作者简历81

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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  本文关键词：乙肝病毒转基因小鼠和多器官障碍综合征模型的评价及药物干预研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：450838