miR-128-2骨髓嵌合和转基因小鼠模型的建立及其免疫表型分析

发布时间：2017-06-15 23:10

  本文关键词：miR-128-2骨髓嵌合和转基因小鼠模型的建立及其免疫表型分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：microRNAs（miRNAs）是真核生物中一类长度约为22个核苷酸，参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA。近年来研究发现，MiRNAs参与了众多的生物学过程，如细胞的增殖分化和凋亡、个体发育和疾病的发生发展。现有的研究表明MiRNAs同样参与了免疫系统的各种细胞的分化发育。为进一步探讨miRNAs在淋巴细胞发育和活化中的作用，我们首先初步研究在部分淋巴细胞（monocytes、proB细胞、T细胞等）中miRNAs的表达差异。结果发现在不同细胞，甚至同一种细胞的不同发育阶段中，其miRNAs的表达谱呈现显著的差异。仔细分析miRNAs在不同免疫细胞中的表达谱，我们发现miR-128-2在DP T细胞中表达与其它检测的细胞有非常显著的差异。由此，在本课题中我们设想通过建立miR-128-2嵌合小鼠模型和miR-128-2转基因小鼠模型来进一步研究miR-128-2在淋巴细胞分化发育中的作用。为此，首先我们通过q-PCR和流式分析鉴定miR-128-2过表达的质粒pmscv-GW-Rfa-eGFP-miR-128-2能成功表达miR-128-2。在此基础上，为更好的研究miR-128-2对淋巴细胞发育的影响，我们一方面通过制备miR-128-2的逆转录病毒，感染骨髓干细胞，并建立miR-128-2过表达嵌合小鼠模型，通过FACS和PCR检测证明我们的嵌合小鼠模型成功建立。另一方面，为得到更好的稳定的研究模型，我们将pmscv-GW-Rfa-eGFP-miR-128-2用ScaI酶切线性化，并应用显微注射受精卵细胞制备miR-128-2转基因小鼠模型，经PCR检测发现，我们得到5只miR-128-2阳性小鼠模型。同时，我们通过构建miR-128-2的海绵miRNAs表达质粒（pMDH-PGK-GFP-miR-128-2-sponge），并建立miR-128-2-sponge嵌合小鼠和转基因小鼠模型，观察阻滞miR-128-2的表达对淋巴细胞发育的影响。进一步通过FACS分析发现：不管在嵌合小鼠中，还是在转基因小鼠模型中，我们均发现过表达miR-128-2后，其T细胞及各种T细胞亚群的比例和其在正常小鼠中发育无显著差异。但我们发现在过表达嵌合小鼠和转基因小鼠中，，不管是在骨髓还是在外周的脾脏中，均出现B细胞的显著减少。而miR-128-2-sponge的嵌合小鼠和转基因小鼠B细胞比例轻度升高。由此我们认为miR-128-2在造血细胞的发育中主要影响了B细胞发育，且呈现为对B细胞的发育阻滞作用。进一步研究发现过表达miR-128-2后，并不影响B细胞的自我更新和凋亡，而是通过阻滞CLP向PreProB发育来实现的。最后，我们通过软件分析和PCR、荧光素酶素报告系统等预测miR-128-2在B细胞发育阻滞中的作用机制，初步发现，miR-128-2可能通过作用于多种基因如BCL11a、MALT、A2b等来调控B细胞的发育。其详细机制有待我们进一步探讨。 总结我们现有的研究，我们成功建立了miR-128-2过表达嵌合小鼠和转基因小鼠动物模型，及miR-128-2-sponge嵌合小鼠和转基因小鼠等四种动物模型，为进一步研究miR-128-2的生物学功能提供强有力的研究工具。免疫表型结果提示miR-128-2主要阻滞了CLP向B细胞的发育。miR-128-2可能通过影响BCL11a、MALT、A2b等多种基因来调控B细胞的发育。这为阐明B细胞发育的分子调控提供了新的理论解释，也为miRNAs在淋巴细胞发育活化中的作用研究提供新的证据。
【关键词】：miRNAs miR-128-2 miR-128-2-sponge 嵌合小鼠 转基因小鼠 B细胞发育
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R392
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 目录8-9
• 前言9-11
• 第一部分 miR-128-2 小鼠模型的建立11-32
• 材料和方法12-25
• 结果25-30
• 讨论30-32
• 第二部分 骨髓嵌合和转基因小鼠的免疫表型分析32-44
• 材料和方法32-34
• 结果34-42
• 讨论42-44
• 第三部分 miR-128-2 靶基因分析44-55
• 材料与方法44-48
• 结果48-51
• 讨论51-55
• 结论55-56
• 参考文献56-60
• 综述60-99
• 参考文献79-99
• 硕士期间完成的论文99-100
• 附录100-104
• 致谢104-105

【共引文献】

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本文编号：453751