TACI-Fc及配体BAFF的表达，纯化和活性研究

发布时间：2017-06-18 14:25

  本文关键词：TACI-Fc及配体BAFF的表达，纯化和活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：B淋巴细胞激活因子(B cell-activation factor,BAFF)和一种诱导增殖配体(Aproliferation-inducing ligand,APRIL),同属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族,并且两者蛋白质序列有33%的同源性。这两种因子有两个共同受体：穿膜蛋白活化物(transmembrane activator and CAML interactor,TACI)和B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen,BCMA)。BAFF和APRIL参与自身免疫性疾病的发生和发展,并成为治疗药物的靶点。本文中我们将TACI胞外区基因与人IgG的Fc片段的DNA序列进行重组,构建毕赤酵母真核表达载体pPIC9K-TACI-Fc,转化毕赤酵母GS115菌种,得到了重组TACI-Fc融合蛋白的表达克隆,并进行诱导表达和纯化及生物学活性的鉴定工作。该项研究取得的主要结果如下： 1)经过重叠PCR成功将TACI胞外区基因与IgG的Fc片段进行重组,融合DNA序列与GenBank序列一致。 2)将TACI-Fc片段插入到毕赤酵母表达质粒pPIC9K中,并转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选出表达克隆。SDS-PAGE分析可见在35kD处有目的蛋白条带。Western Bloting结果显示该蛋白与抗TACI的单克隆抗体呈阳性反应。 3)进行TACI-Fc毕赤酵母表达菌的高密度发酵工作,并经过超滤、分子筛及proteinA蛋白亲和层析等纯化技术纯化出TACI-Fc融合蛋白。 4)构建BAFF原核表达载体pET32a-BAFF,并转化大肠杆菌BL21菌种Transetta,经IPTG诱导,并优化诱导条件,成功实现了BAFF的高效可溶性表达。随后进行组氨酸蛋白亲和层析将BAFF纯化,得到较高纯度的BAFF蛋白。 5)将纯化的BAFF和TACI-Fc进行诱导Raji增殖实验,结果显示表达纯化的BAFF可以促进Raji B淋巴瘤细胞增殖,并TACI-Fc可以减弱BAFF和APRIL对RajiB淋巴瘤细胞的增殖作用。
【关键词】：融合蛋白TACI-Fc BAFF 毕赤酵母 原核表达 Raji B细胞
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 英文缩写3-4
• 中文摘要4-5
• Abstract5-6
• 前言6-16
• 参考文献11-16
• 第一部分 TACI-Fc融合蛋白的表达、纯化16-35
• 引言16-17
• 材料与方法17-27
• 结果27-33
• 讨论33-34
• 小结34-35
• 第二部分 BAFF蛋白的表达及纯化35-46
• 引言35
• 材料与方法35-40
• 结果40-44
• 讨论44-45
• 小结45-46
• 第三部分 TACI-Fc阻断BAFF/APRIL对Raji B细胞的增殖作用46-54
• 引言46
• 材料与方法46-48
• 结果48-53
• 讨论53-54
• 总结与讨论54-56
• 参考文献56-58
• 综述：BAFF/APRIL与自身免疫性疾病的关系58-75
• 参考文献66-75
• 致谢75-76

【共引文献】

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本文编号：459694