人β-COP-shRNA慢病毒载体构建及干扰效应检测

发布时间：2017-06-19 18:16

  本文关键词：人β-COP-shRNA慢病毒载体构建及干扰效应检测，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的采用常规转染试剂难以将人β-COP-shRNA转染至THP-1细胞。构建人β-COP特异性的shRNA慢病毒载体,并测定其对靶基因β-COP的抑制效应。方法设计合成针对人β-COP基因靶点特异的4对shRNA寡聚单链DNA,插入p GMLV-SC1载体中,构建慢病毒重组载体。将重组载体和包装质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒并测定滴度。用慢病毒感染THP-1细胞,定量PCR和Western blot检测干扰载体对β-COP基因的干扰效果。结果测序证实,β-COP基因的shRNA寡聚核苷酸序列已插入慢病毒载体,转染HEK 293T细胞,经包装得到4种慢病毒,病毒滴度为1×109TU/m L。定量PCR分析显示,4种β-COP-shRNA慢病毒感染的THP-1细胞中β-COP基因mRNA表达量分别为0.831±0.065、0.675±0.079、0.260±0.050、0.497±0.067,较对照(1.000±0.000)明显升高(P0.01);其抑制率分别为16.9%、32.5%、74.0%和50.3%。Western blot结果表明,4种干扰载体均可抑制β-COP蛋白表达,其中β-COP-shRNA 3的沉默效率为76.4%。结论成功构建了人β-COP-shRNA干扰载体,证实了干扰载体对靶基因有较好的沉默效果。
【作者单位】： 广东医学院生物化学与分子生物学教研室;深圳市龙岗区人民医院检验科;
【关键词】： 人β-COP shRNA干扰载体 脂质代谢
【基金】：国家自然科学基金(81170267) 广东省自然科学基金(S2011010002984) 东莞市高等院校科研机构科技计划项目(2012108102037)
【分类号】：R373
【正文快照】： 0引言脂质代谢紊乱可引起动脉粥样硬化、冠心病、肥胖症、糖尿病及脂肪肝等多种代谢相关性疾病,严重威胁人类健康[1]。高密度脂蛋白(high density lipo-protein,HDL)能逆向转运胆固醇,改善脂质代谢异常[2-3]。研究发现,HDL促进脂质分泌是受体介导的胞吐过程[4-5],高密度载脂蛋

【参考文献】

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1 王强;杭涛;徐云;程训民;张启高;宫剑滨;王t，

本文编号：463386