预测的鹦鹉热嗜衣原体Ⅲ型分泌系统效应蛋白的定位及相关性质的初步研究

发布时间：2017-06-20 10:05

  本文关键词：预测的鹦鹉热嗜衣原体Ⅲ型分泌系统效应蛋白的定位及相关性质的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：鹦鹉热嗜衣原体（Chlamydophila psittaci， Cps）是一种严格细胞内寄生，多宿主性的人兽共患病病原体，临床上仍缺乏有效的防治药物。寻找Cps和宿主细胞相互作用的关键效应蛋白，以作为研制防治性药物的靶点是目前衣原体研究的“热点”课题。现有资料表明Ⅲ型分泌系统（Type III secretion system，T3SS）效应蛋白是Cps与宿主细胞相互作用的关键。本研究对预测、筛选的Cps T3SS效应蛋白的定位和表达进行了初步的分析，并进一步对其体外诱导人单核细胞（THP-1）分泌IL-6、IL-1β、TNF-α前炎症因子（CKs）的水平进行了检测。 方法：将预测的Cps T3SS效应蛋白编码基因，经原核表达、纯化后获得融合蛋白，用融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，并以多克隆抗体为一抗，采用间接免疫荧光技术检测预测蛋白在感染细胞的定位情况。分别在Cps感染Hela细胞后8h，18h，24h，36h，48h提取蛋白，用制备的一抗通过Western Blot（WB）来观察蛋白表达时相。将多粘菌素B处理过的GST-CPSIT_0271蛋白体外刺激THP-1细胞，并于6h、12h、24h、36h、48h收集细胞，采用ELISA检测IL-6、TNF-α和IL-1β水平。 结果： 1.构建的10个预测Cps T3SS效应蛋白编码基因的重组质粒：CPSIT_0139，CPSIT_0271， CPSIT_0363， CPSIT_0499， CPSIT_0700， CPSIT_0788，CPSIT_0803，CPSIT_0959，CPSIT_0965，CPSIT_0991，经测序鉴定证实插入片段为目的基因，测序结果与Genbank上登录序列经BLAST比对完全一致；经诱导表达获得6个可溶性表达蛋白，分别是：CPSIT_0139，CPSIT_0271，CPSIT_0363，CPSIT_0700，CPSIT_0788，CPSIT_0959；间接ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的效价：CPSIT_0363与CPSIT_0959为1:64000，CPSIT_0700与CPSIT_0788为1:32000，CPSIT_0271与CPSIT_0139为1:16000； 2.间接免疫荧光法显示预测蛋白的分布与Cps包涵体的分布位置大致相同； 3. WB结果显示CPSIT_0139， CPSIT_0271， CPSIT_0363， CPSIT_0700，CPSIT_0788，，CPSIT_0959分别在感染后24h，36h，18h，24h，36h，18h才出现明显的蛋白表达； 4.一定浓度的GST-CPSIT_0271蛋白能显著诱导THP-1细胞产生IL-6、TNF-α和IL-1β，当GST-CPSIT_0271蛋白浓度为2μg/mL~5μg/mL时，CKs的水平与蛋白呈明显的剂量依赖关系；用5μg/mL的GST-CPSIT_0271蛋白刺激THP-1细胞24h时，TNF-α和IL-1β量达到高峰，随后它们的水平逐渐下降，48h时IL-6量达到高峰。 结论： 1. CPSIT_0139， CPSIT_0271， CPSIT_0363， CPSIT_0700， CPSIT_0788，CPSIT_0959重组蛋白具有良好的免疫原性，能刺激小鼠产生较高效价的抗体；CPSIT_0139，CPSIT_0271，CPSIT_0363，CPSIT_0700，CPSIT_0788，CPSIT_095可能分布在包涵体内或包涵体膜上； 2. CPSIT_0139、CPSIT_0271、CPSIT_0700和CPSIT_0788可能是衣原体在感染晚期表达的基因，CPSIT_0363和CPSIT_0959则可能是感染中期表达的基因； 3. GST-CPSIT_0271蛋白能促进THP-1细胞分泌炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β。
【关键词】：鹦鹉热嗜衣原体 Ⅲ型分泌系统 效应蛋白 表达时相 细胞因子
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R374.2
【目录】：

• 主要中英文缩写4-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-13
• 实验材料13-16
• 实验方法16-26
• 实验结果26-34
• 讨论34-38
• 结论38-39
• 参考文献39-41
• 综述41-48
• 参考文献46-48
• 发表的论文与参与课题48-49
• 致谢49

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 宋立华;何君;李岩伟;赵海;段鸿元;朱虹;端青;;鹦鹉热嗜衣原体两对荧光定量PCR引物的应用与比较[J];中国人兽共患病学报;2009年12期

  本文关键词：预测的鹦鹉热嗜衣原体Ⅲ型分泌系统效应蛋白的定位及相关性质的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：465238