人组织相容性Ⅰ类相关链A位点抗原性在移植免疫中的基础与临床研究

发布时间：2017-06-20 11:15

  本文关键词：人组织相容性Ⅰ类相关链A位点抗原性在移植免疫中的基础与临床研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统对MICA*008胞外区序列进行重组蛋白的表达，为研究抗MICA抗体介导体液免疫奠定物质基础。通过对肾移植受者移植前后抗MICA抗体的随访检测，结合MICA基因分型分析肾移植术前和术后新生抗MICA特异性抗体在移植肾功能减退中的意义。通过对国际协作组抗MICA抗体结果进行整体汇总和对比分析，对在临床推广应用的MICA特异性抗体检测起一定的指导作用。 方法： 第一部分：选取人群中最常见的MICA*008等位基因，利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行MICA*008胞外区序列的重组蛋白的表达，首先将转移载体pFastBac-MICA*008转化到E.coil DH10Bac中进行转座，通过蓝白斑筛选和测序鉴定，获得Bacmid-MICA*008，用脂质体转染昆虫细胞SF9，收获培养上清，镍柱纯化上清中的表达产物，经Western blot和考马斯亮蓝染色鉴定重组蛋白。 第二部分：采用免疫磁珠流式细胞仪液相芯片技术（Luminex技术），对82例肾移植受者进行移植前抗MICA抗体检测和移植后四年的动态随访，结合供受者MICA基因分型分析移植后新生抗MICA特异性抗体类型，分析其与移植肾功能的相关性。在移植后1个月，3个月，6个月，，12个月，24个月，36个月，48个月等动态随访点比较抗体阴性组和抗MICA抗体阳性组血清肌酐平均值的差异，并分析统计学差异。 第三部分：对16届国际组织相容性和遗传免疫协作组发放的16份血清样本采用Luminex技术检测抗MICA抗体的特异性。将此次协作组结果汇总，按各实验室使用的三种抗MICA抗体试剂类型将结果分类分析，三种试剂分别标记为Kit-A，B，C。结合本实验室及协作组结果，分析三种检测试剂检测抗MICA特异性抗体结果的异同。 结果： 第一部分：转座后的Bacmid-MICA*008经测序鉴定和Blast比对，插入序列与MICA*008序列一致。收集转染后P3代的病毒上清液，经镍柱纯化最终获得重组MICA08蛋白约1.5mg/L左右，经Western blot和考马斯亮蓝染色鉴定，重组蛋白片段大小约37kDa，与目的蛋白大小相符。 第二部分：研究表明抗MICA抗体存在于12.2%（10/82）的肾移植前患者中。10例移植前抗MICA抗体阳性受者中有3例移植后新生抗MICA抗体，另外7例随访期间抗MICA抗体的特异性类型均无改变。1例移植术前抗体阴性移植后3个月新生抗MICA抗体。结合供受者MICA基因分型判断有2例受者新生的抗体为抗供者特异性抗体且出现相关的临床排斥反应，2例受者新生的为非供者特异性抗体。抗MICA抗体阳性组平均血清肌酐水平均高于抗体阴性组，在随访至36~48个月后具有统计学意义。 第三部分：在16份血清标本中S04为阴性，15份标本结果阳性，其中S10标本各实验室均上报为阳性。依据MICA抗原公共表位分G1组(MICA-01，02，07，12，17，18）和G2(MICA-04，06，08/27，09，19)组，5例标本用Kit-A和B均能判别MICA-G1组特异性抗体，Kit-C存在MICA08/27，MICA19的假阳性结果。5例标本用Kit-A和B均能判别MICA-G2组特异性抗体。其余5例标本用Kit-A，B，C均无法判别MICA特异性抗体一致的结果。从三种试剂均能判别10种MICA特异性抗体结果分析，MICA08/27（86.67%，13/15）抗体结果一致性最高，MICA19（40%，6/15）一致性最低。使用Kit-B试剂的实验室间有13例MICA特异性抗体标本结果符合率大于80%。 结论：1.应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统可高效表达重组MICA08蛋白，而通过镍柱亲和层析纯化P3病毒上清液可制备高纯度的重组MICA08蛋白。2.应用免疫磁珠流式细胞仪液相芯片技术可检测抗MICA特异性抗体，供、受者MICA基因错配是产生新生抗体的重要原因，预存和新生抗MICA抗体与移植后肾功能减退密切相关，而新生的DSA抗MICA抗体是移植排斥反应的重要原因。3.三种检测抗MICA特异性抗体试剂均对检测结果的阴性或阳性判断没有差异，但对MICA抗体特异性分析存在不一致，有争议的MICA特异性类型可选择两种以上的试剂进行对比检测。
【关键词】：抗MICA抗体 MICA分子 重组MICA蛋白 肾移植
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-16
• 参考文献13-16
• 第一部分 利用杆状病毒-昆虫细胞系统表达 MICA08 重组蛋白16-40
• 引言16
• 材料与方法16-30
• 结果30-35
• 讨论35-38
• 参考文献38-40
• 第二部分 抗 MICA 特异性抗体的检测及在移植肾功能减退中的价值40-54
• 引言40
• 资料与方法40-46
• 结果46-50
• 讨论50-52
• 参考文献52-54
• 第三部分 国际协作组特异性 MICA 抗体的结果分析及预示的临床应用价值54-62
• 引言54
• 资料与方法54-55
• 结果55-58
• 讨论58-60
• 参考文献60-62
• 全文总结62-63
• 综述63-72
• 参考文献69-72
• 公开发表的论文72-73
• 致谢73-74

【共引文献】

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本文编号：465457