低氧对线粒体自噬的影响及BNIP3介导的调控作用研究

发布时间：2017-06-20 13:06

  本文关键词：低氧对线粒体自噬的影响及BNIP3介导的调控作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：氧作为细胞代谢线粒体氧化磷酸化的重要底物，对细胞的存活具有重要的调节作用。近年来越来越多的研究显示：适度低氧促进细胞的增殖和存活；而严重低氧导致细胞的死亡。研究不同低氧条件下细胞代谢水平的改变，有助于人们更深入地了解机体对低氧的适应性调节机制。当细胞遭受低氧刺激时，因为线粒体电子传递链中作为电子最终受体的氧分子供应不足，导致电子传递链（ElectronTransport Chain，ETC）产生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），大量产生的活性氧会对细胞中大分子和细胞器造成损伤，最终导致细胞功能紊乱或细胞死亡。 线粒体自噬（mitophagy）是近年来被发现的细胞在多种应激刺激下的一种适应性代谢反应。自噬过去一直被视为细胞死亡的一种方式，近年来随着对自噬研究的深入，自噬被发现作为一种重要的机体适应性反应，在机体应对应激环境时行使重要的促存活作用。线粒体自噬作为自噬的一种形式，能通过自噬-溶酶体途径特异性地降解受损的线粒体，维持细胞中活性氧的水平，防止细胞中因为ROS、MMP（Mitochondrial Membrane Potential）等造成的线粒体内容物的释放和线粒体途径的细胞凋亡或坏死。因此，线粒体自噬被认为在多种应激条件下发挥着重要的促存活作用。近期研究表明，细胞在低氧条件下能通过激活低氧诱导因子（Hypoxia-Inducible Factor1，HIF-1）和BNIP3（Bcl-2and adenovirus E1B19kDa-interacting protein3）介导的PI3K（phosphatidylinositol-3-kinase）通路诱导线粒体自噬，减少活性氧ROS的产生，促进细胞的存活和低氧适应。 BNIP3是Bcl-2家族中BH3-only亚家族的成员，它是一种线粒体外膜蛋白，也是HIF-1的靶基因。在低氧时能被HIF-1转录激活，使BNIP3表达上调。早期的研究显示低氧下BNIP3在线粒体途径的凋亡和坏死中起重要作用。近几年越来越多的研究证明BNIP3在线粒体自噬中也发挥着重要作用。因而，关于低氧下BNIP3的功能探讨存在着两种不同的观点。 在本研究中，我们探讨了不同氧浓度下线粒体自噬的发生；其对细胞存活的影响，以及BNIP3在不同氧浓度下表达和对线粒体自噬及细胞存活的影响。研究中，我们用0.3%O2和10%O2为低氧模型，检测不同氧浓度对PC12细胞存活与线粒体自噬的影响，并进一步探讨了BNIP3在不同低氧条件下对线粒体自噬的调控作用。 主要研究结果如下： 1.不同低氧对细胞存活状态的影响 我们采用适度低氧（10%O2，24h）和严重低氧（0.3%O2，24h）两种低氧模型，通过比较不同氧浓度下细胞存活率，总抗氧化能力（Total Anti-Oxidantcapacity，T-AOC），活性氧含量，细胞凋亡和增殖能力，确定适度低氧和严重低氧对细胞存活状态的影响。 1.1细胞存活 我们通过MTT实验比较不同氧浓度，不同低氧处理时间对不同接种密度下PC12细胞存活能力的影响。实验结果表明：经10%O2低氧处理24h和48h后存活能力都显著增加；而0.3%O2低氧条件下，低氧处理24h或48h，均明显抑制PC12细胞的存活。 1.2总抗氧化能力 我们进一步通过总抗氧化能力试剂盒检测了PC12细胞的总抗氧化能力。结果显示：10%O2处理24h后，细胞的总抗氧化力较常氧组有升高的趋势，但无统计学差异；0.3%O2处理24h后，细胞的总抗氧化能力较常氧组明显地降低。 1.3活性氧含量 此外，我们用荧光标记的ROS分子探针孵育细胞，染色后检测结果显示：与常氧对照相比，10%O2处理24h后，细胞经过ROS探针分子染色后荧光强度无显著变化。0.3%O2处理24h后，细胞经过ROS探针分子染色后的荧光强度增加了约2倍。 1.4细胞凋亡 由于ROS大量产生是诱导细胞凋亡的机制之一，我们进一步通过TUNEL染色、Annexin V/PI双染和Western Blot检测凋亡标记分子caspase-3和caspase-9的剪切活化观察了不同氧浓度对PC12细胞凋亡的影响。实验结果显示，在常氧和10%O2处理24h后，细胞的凋亡率较低，而经过0.3%O2处理24h后，PC12细胞的凋亡率显著升高。 1.5细胞增殖 不同低氧条件下，除了细胞凋亡影响细胞的存活外，低氧对细胞增殖的作用也会影响细胞的存活数目。因此，我们又进一步检测了不同低氧对细胞增殖的影响。通过PI染色流式检测细胞周期和BrdU掺入法观察不同氧浓度下PC12细胞的增殖状态。结果显示：10%O2处理24h后细胞增殖较常氧无显著变化，0.3%O2处理24h后细胞增殖减少。 通过上述实验，我们确定了适度低氧（10%O2，24h）和严重低氧（0.3%O2，24h）两种不同低氧模型，PC12细胞在两种不同氧浓度下存活状态截然不同。 2.不同低氧对线粒体自噬的影响及线粒体自噬在细胞存活状态中的作用 线粒体自噬是新近报道的低氧条件下减少过量ROS产生的适应性代谢反应。不同氧浓度对线粒体自噬的发生有何影响？细胞对不同低氧刺激的迥异反应是否通过对线粒体自噬的不同调节来实现的？为阐明这些问题，我们分别进行了以下实验研究。 2.1不同低氧下的线粒体自噬 将PC12细胞进行适度低氧（10%O2）和严重低氧（0.3%O2）处理24小时后，我们用电子显微镜、Western Blot和荧光共定位分析等检测方法，观察了不同低氧条件对PC12细胞线粒体自噬的影响。与常氧对照相比，适度低氧促进细胞中线粒体自噬的发生；而严重低氧后，线粒体自噬明显减少。 2.2抑制线粒体自噬对细胞存活状态的影响 为进一步确定线粒体自噬在不同低氧中对细胞存活状态的调节作用，我们用自噬抑制剂3-MA处理PC12细胞，然后分别观察了细胞存活能力，活性氧含量和细胞凋亡情况，以鉴别线粒体自噬对细胞存活状态的影响。(1) MTT检测细胞存活率的结果显示：在常氧和适度低氧条件下，不同浓度的3-MA处理均能导致细胞存活率显著降低；而在严重低氧条件下，不同浓度的3-MA处理对细胞存活率的影响均不明显。(2) ROS探针分子检测细胞活性氧含量的结果显示：常氧条件下，细胞经过3-MA处理后ROS阳性细胞的数量无显著变化；而在适度低氧条件下，3-MA处理后ROS的阳性细胞率增加显著；在严重低氧条件下，3-MA处理后ROS阳性细胞率也有所增加。(3) TUNEL检测细胞凋亡的结果显示：常氧条件下，细胞经过3-MA处理后凋亡率并未显著升高，而在适度低氧和严重低氧条件下，3-MA处理均能诱导细胞凋亡增多。 2.3比较线粒体自噬和凋亡对细胞存活状态的影响 适度低氧和严重低氧时PC12细胞中线粒体自噬和细胞凋亡的发生相反，为了明确这两种低氧条件下细胞是以促进细胞存活的线粒体自噬为主要途径，还是促进细胞死亡的凋亡途径占主导作用？我们同时使用了抑制凋亡途径的抑制剂Z-VAD和抑制自噬发生的抑制剂3-MA，分别通过MTT和TUNEL染色观察了抑制自噬与凋亡后细胞存活能力的改变情况。结果显示：适度低氧条件下，3-MA处理后细胞凋亡增加，细胞存活率降低，而Z-VAD处理对细胞的存活状态无显著影响；在严重低氧条件下，3-MA处理后细胞凋亡和存活率均无显著影响，而Z-VAD处理后细胞的凋亡降低，同时细胞存活率升高。 3.低氧对BNIP3表达的影响及其对线粒体自噬的调控作用 3.1不同低氧下的BNIP3表达 我们检测了不同氧浓度处理24h后BNIP3表达情况。实验结果显示：在常氧条件下，BNIP3有少量的表达；适度低氧处理后，BNIP3的表达显著升高；而严重低氧处理后，BNIP3的表达显著降低。 我们进一步用real-time PCR和Western Blot技术检测了BNIP3mRNA和蛋白在不同时间点的表达情况。实验结果显示：适度低氧条件下，BNIP3mRNA和蛋白水平随着低氧时间而逐渐增加；严重低氧条件下，BNIP3mRNA表达随着低氧时间明显增加，而其蛋白表达却表现出先升后降的特点，这表明BNIP3蛋白的表达可能存在翻译后修饰的调控。 3.2BNIP3过表达对线粒体自噬的影响 用带有flag标签的BNIP3质粒转染PC12细胞，我们通过Western Blot检测线粒体自噬的标记分子，结果显示过表达BNIP3能显著增加线粒体自噬的发生。 3.3BNIP3siRNA对细胞存活、凋亡和线粒体自噬的影响 用BNIP3siRNA转染PC12细胞，我们分别通过MTT、Western Blot和TUNEL染色检测了不同低氧条件下BNIP3表达被抑制后对细胞存活、凋亡以及线粒体自噬的影响。结果显示：适度低氧时，BNIP3siRNA处理后抑制线粒体自噬的发生和细胞存活；而严重低氧时，抑制BNIP3的表达后，对细胞存活、凋亡和线粒体自噬无明显影响。 综上所述，本研究证明了适度低氧条件（10%O2）下，PC12细胞通过线粒体自噬清除细胞中的过量ROS，维持氧化还原平衡，减少凋亡发生，促进细胞存活。重低氧条件（0.3%O2）下，PC12细胞中的线粒体自噬不足以清除细胞中的过量ROS，细胞氧化还原失衡，细胞凋亡增多，细胞存活降低BNIP3蛋白表达差异介导了不同氧浓度下细胞的存活。首次阐明了不同低氧条件下，线粒体自噬的发生和BNIP3的调控作用。该研究从全新的角度对于不同低氧所产生的细胞代谢及存活能力的不同作用进行了深入分析，，同时也为BNIP3所介导的线粒体自噬研究增添了新的内容。
【关键词】：低氧 线粒体自噬 BNIP3 PC12 活性氧
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 缩写词表5-6
• 摘要6-10
• Abstract10-15
• 前言15-20
• 材料与方法20-34
• 1. 实验材料20-23
• 2. 实验方法23-34
• 实验结果34-56
• 1. 不同低氧对细胞存活状态的影响34-39
• 1.1 细胞存活34-35
• 1.2 总抗氧化能力35
• 1.3 活性氧含量35-37
• 1.4 细胞凋亡37-38
• 1.5 细胞增殖38-39
• 2. 不同低氧对线粒体自噬的影响及线粒体自噬在细胞存活状态中的作用39-49
• 2.1 不同低氧下的线粒体自噬40-43
• 2.2 抑制线粒体自噬对细胞存活状态的影响43-47
• 2.3 比较线粒体自噬和凋亡对细胞存活状态的影响47-49
• 3. 低氧对 BNIP3 表达的影响及其对线粒体自噬的调控作用49-56
• 3.1 低氧下 BNIP3 表达的动态变化49-52
• 3.2 BNIP3 过表达对线粒体自噬的影响52-53
• 3.3 BNIP3 siRNA 对细胞存活、凋亡和线粒体自噬的影响53-56
• 讨论56-61
• 1. 低氧下的线粒体自噬及其在细胞存活中的作用56-57
• 2. 低氧对 BNIP3 表达的影响及与线粒体自噬的关系57-61
• 结论61-62
• 参考文献62-67
• 论文发表情况及会议摘要67-68
• 个人简历68-69
• 致谢69

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本文编号：465681