人源抗EV71病毒Fab噬菌体抗体库的构建和筛选

发布时间：2017-06-24 06:04

  本文关键词：人源抗EV71病毒Fab噬菌体抗体库的构建和筛选，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的本研究采用噬菌体表面展示技术进行人源抗EV71病毒Fab噬菌体抗体库的构建和筛选，目的在于获得特异性针对EV71病毒、具有中和活性的人源性单克隆抗体，为EV71感染引起的手足口病的临床防治提供备择方案。方法采集16名志愿者外周血，利用间接免疫荧光（IFA）法检测血清抗体，并利用中和实验检测血清EV71病毒中和抗体滴度，筛选出EV71病毒血清中和抗体效价为1:128的成人的外周血，分离其淋巴细胞，提取总RNA并逆转录为cDNA。以cDNA为模板，运用人源抗体Fab段基因引物扩增出人源抗体轻链及重链Fd区，分步克隆至pComb3载体，并验证轻、重链插入率。使用辅助噬菌体VCSM13感染重组大肠杆菌XL1-Blue，，对Fab噬菌体抗体库进行包装。在此基础上，以EV71病毒结构蛋白VP1上的中和线性表位SP70为抗原对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选，经过三轮“吸附-洗脱-富集”的过程后，将获得的重组噬菌体感染大肠杆菌XL1-Blue并诱导表达，利用SP70包被高吸附96孔板，对诱导表达后的菌上清进行筛选。结果（1）所构建的重组载体的轻、重链插入率均接近100%，所构建的Fab噬菌体抗体库的库容可达到108，满足抗EV71病毒Fab抗体筛选所需。（2）经过三轮“吸附-洗脱-富集”的过程，共获得51株表达具有SP70多肽特异性结合活性及Fab活性重组蛋白的克隆，通过序列测定确定其基因序列，与Internet V-Base基因库比对确定IgG家族，与IMGT/V-QUEST数据库比对，确定51株阳性克隆的抗体轻、重链型别。结果显示共获得了3株轻、重链基因组合序列不相同的克隆株。ELISA实验进一步证明了这3株Fab抗体可特异性结合SP70多肽。结论本研究运用噬菌体抗体库技术，成功构建了人源抗EV71病毒Fab噬菌体抗体库，并从中筛选出了3株特异性针对EV71病毒结构蛋白VP1上的中和线性表位SP70的人源Fab抗体。
【关键词】：人源化抗体 抗体Fab段 噬菌体抗体库 EV71
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 英文缩略词表4-6
• 中文摘要6-7
• 英文摘要7-8
• 第一部分：人源抗 EV71 病毒 Fab 噬菌体抗体库的构建8-32
• 前言8-10
• 材料与方法10-23
• 结果23-29
• 讨论29-32
• 第二部分：人源抗 EV71 病毒 Fab 噬菌体抗体库的筛选32-43
• 前言32-33
• 材料与方法33-38
• 结果38-41
• 讨论41-43
• 结论43-44
• 参考文献44-47
• 致谢47-48
• 文献综述48-55
• 参考文献53-55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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  本文关键词：人源抗EV71病毒Fab噬菌体抗体库的构建和筛选，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：477238