Saos-2细胞和U2-OS细胞基质小泡比较蛋白质组学研究

发布时间：2017-06-24 10:02

  本文关键词：Saos-2细胞和U2-OS细胞基质小泡比较蛋白质组学研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，在细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的合成、分泌和矿化过程中发挥重要作用，可分泌类骨质包被自身从而转变为骨细胞。除了类骨质外，成骨细胞还可分泌基质小泡（matrix vesicles, MV）。MV主要分布在骨、软骨和牙本质的基质中，有膜包被，富含Ca2+和PO43+，内有细小的钙化结晶，富含多种磷脂和蛋白，在骨矿化过程起始阶段起着重要作用。MV可以调节细胞内外基质中的磷酸盐（Pi）和无机焦磷酸磷酸盐（PPi）的比例，促进矿化物形成，一般被认为是钙化的起始部位。在骨矿化过程中，MV中的钙化结晶释放到成骨细胞分泌的类骨质，形成羟基磷灰石（hydroxyapatite, HA）。HA在软骨或成骨细胞的ECM胶原纤维中的沉积，促进了软骨或骨的矿化。 对MV表面受体、离子通道和转运蛋白参与矿化进程的研究也发现，MV蛋白可调节细胞内外基质中的Pi与PPi比例，结合钙离子，抑制钙化或充当成核因子，提供HA成核位点，对正常骨矿化进程起到重要作用，其异常则可能导致矿化物聚集或矿化不足。MV蛋白突变可能从无机离子的比例、酶的活性及成核位点的形成等多方面影响矿化，产生不同程度的矿化异常，导致异位矿化或矿化不足类疾病，而这些疾病在临床上是广泛存在的。因此，对MV参与矿化机制的研究具有重要的临床意义和生物学意义，从MV水平寻找调节矿化的调控因子，可能为病理性矿化的机制研究和治疗提供理论基础和临床依据。目前认为，MV对钙化的促进至少有两大作用1）MV酶可以调节细胞内外的Pi/PPi比例；2）MV蛋白质和脂质，包括酸性磷脂，可作为HA沉积形成的初始晶核。目前蛋白质组学研究已发现2000多种与矿化相关的MV蛋白。大量研究表明， MV蛋白缺乏可能与许多罕见的骨骼类疾病的病理矿化进程密切相关，然而绝大对数蛋白在矿化中所起的调节作用目前仍不明确。 U2-OS细胞是一种低磷酸酯酶活性、矿化能力缺陷的成骨细胞，而Saos-2细胞是一种具有显著矿化能力的成骨细胞。上述两种细胞均属人骨肉瘤细胞。本实验室分别从矿化诱导的Saos-2细胞和U2-OS细胞的ECM中提取MV，然后进行比较蛋白质组学分析，以期发现差异表达的MV蛋白。 目的：培养矿化能力明显差异的骨肉瘤细胞Saos-2和U2-OS，用矿化诱导培养基诱导培养细胞，提取细胞分泌的基质小泡并进行鉴定。比较蛋白质组学分析MV蛋白，寻找骨矿化相关的差异蛋白，为探索MV在矿化进程中的作用提供新的线索。 方法：用含10mM β-磷酸甘油、50μg/mLVc的DMEM和Mccoy′s5AMedium诱导培养Saos-2和U2-OS细胞。分别提取Saos-2和U2-OS细胞基质小泡，并通过流式细胞术和电镜技术鉴定所提取的MV，对MV蛋白进行比较蛋白质组学分析；使用MAS3.0分析软件对蛋白质组学分析所得的差异蛋白作进一步分析；筛选出的差异蛋白经western-blotting进行再验证。 结果：从Saos-2和U2-OS细胞中均成功提取获得MV。经电镜和流式细胞仪检测，，可观察到本实验室所提取的沉淀直径为50-200nm的小囊泡，并且正常的Saos-2和U2-OS细胞以及矿化诱导7天的U2-OS细胞的提取物中均未发现矿化物结晶，而在矿化诱导7天的Saos-2细胞的提取物中存在包含于囊泡中的矿化物结晶。我们对这两种细胞的MV进行蛋白质组学分析，共发现175种骨矿化相关的差异表达蛋白（表达量比值2），包括89种上调表达蛋白和86种下调表达蛋白（Saos-2/U2-OS）。我们使用MAS3.0在线分析软件对89种上调表达蛋白进行生物信息学分析，发现12例钙结合蛋白，8例参与了骨相关信号转导途径的蛋白。选取蛋白激酶C-α（proteinKinase C α，PKCα）和RAS相关蛋白Ral-A（ras-related protein Ral-A，Rala）两种表达上调的差异蛋白进行western-blotting验证，发现与蛋白质组学分析结果基本一致。 结论：诱导矿化7天的Saos-2和U2-OS细胞呈现明显差异的矿化现象，提取的基质小泡经电镜检测发现矿化诱导7天的Saos-2细胞MV中有矿化结节的存在，而矿化诱导7天的U2-OS细胞MV中则未观察到矿化结节的存在。这个结果从一定程度上表明了，MV为成骨细胞骨矿化提供了成核位点，可能是骨矿化的起始位置。对这两种矿化能力有明显差异的成骨细胞MV进行蛋白质组学分析，筛选与矿化相关的差异蛋白，为探讨MV蛋白在矿化过程中所发挥的作用和初步探索MV在骨矿化过程中的作用机制提供了一定的理论基础和实验依据。
【关键词】：基质小泡 成骨细胞 矿化 蛋白质组学
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 导师简介5
• 课题组成5-8
• 摘要8-11
• Abstract11-14
• 英文缩略词表14-15
• 第一章 前言15-22
• 1.1 基质小泡的定义15-17
• 1.2 基质小泡主要蛋白与矿化形成的关系17-21
• 1.3 总结21-22
• 第二章 SAOS-2 和 U2-OS 细胞培养和基质小泡的提取及鉴定22-29
• 2.1 材料22
• 2.1.1 细胞22
• 2.1.2 主要试剂22
• 2.1.3 主要仪器22
• 2.2 实验方法22-25
• 2.2.1 细胞培养22-23
• 2.2.2 细胞的诱导条件和方法23
• 2.2.3 SAOS-2 和 U2-OS 细胞矿化的茜素红检测23-24
• 2.2.4 基质小泡的提取24
• 2.2.5 基质小泡的电镜鉴定24
• 2.2.6 基质小泡的流式细胞仪鉴定24-25
• 2.3 实验结果25-28
• 2.3.1 SAOS-2 和 U2-OS 细胞矿化诱导的茜素红检测结果25-26
• 2.3.2 基质小泡的提取结果26
• 2.3.3 基质小泡的电镜鉴定结果26-27
• 2.3.4 基质小泡的流式细胞仪鉴定结果27-28
• 2.4 讨论28-29
• 第三章 基质小泡蛋白质组学29-38
• 3.1 材料29
• 3.1.1 主要试剂29
• 3.1.2 主要仪器29
• 3.2 基质小泡蛋白的非标记定量蛋白质组学分析29-31
• 3.2.1 蛋白质的提取和定量29
• 3.2.2 SDS-PAGE 试验29
• 3.2.3 FASP 酶解蛋白29-30
• 3.2.4 MV 蛋白的 LCMS/MS 分析30
• 3.2.5 质谱数据的非标记定量分析30-31
• 3.2.6 MV 蛋白表达谱的生物信息学分析31
• 3.3 差异表达蛋白的筛选31
• 3.4 免疫印迹法验证差异表达蛋白31-33
• 3.4.1 提取总蛋白31
• 3.4.2 蛋白定量31
• 3.4.3 SDS-PAGE 电泳31-32
• 3.4.4 半干法转膜32
• 3.4.5 封闭32
• 3.4.6 杂交一抗32
• 3.4.7 洗膜32-33
• 3.4.8 杂交二抗33
• 3.4.9 洗膜33
• 3.4.10 检测33
• 3.4.11 成像33
• 3.5 结果33-36
• 3.5.1 基质小泡蛋白的质谱分析结果33
• 3.5.2 差异蛋白的生物信息学分析和免疫印迹验证结果33-36
• 3.6 实验讨论36-38
• 参考文献38-41
• 附录41-66
• 文献综述66-77
• 参考文献74-77
• 已发表论文77-78
• 致谢78

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 栾静;崔亚洲;周小艳;韩金祥;;基质小泡蛋白与骨矿化[J];国际骨科学杂志;2011年05期

2 周小艳;崔亚洲;韩金祥;;2011～2012年骨分子生物学研究进展[J];国际骨科学杂志;2013年06期

3 王小康;王桂霞;张会丰;;糖皮质激素影响小儿长骨发育的研究[J];临床荟萃;2007年07期

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 杨允;他汀类药物对同种异体皮质骨颈椎椎体间移植融合过程的影响[D];山东大学;2004年

2 颉强;骨骺损伤畸形愈合分子机制及预防方法的初步研究[D];第四军医大学;2008年

3 李丽娜;特效识别和酶活性抑制：矿化机理的化学和生物化学研究[D];吉林大学;2008年

4 蒋谊;Ghrelin通过MAPK-ERK信号通路抑制血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的作用机制研究[D];中南大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前7条

1 徐启明;基质金属蛋白酶-3及其组织抑制物-1在兔腰椎间骨缺损及生长板中的表达[D];北京中医药大学;2011年

2 宋鹏;蛇床子素的抗骨质疏松作用及其分子机制研究[D];兰州理工大学;2013年

3 高Z

本文编号：477780