重构大鼠脊髓星形胶质细胞骨架对AQP4和Kir4.1基因表达影响的实验研究

发布时间：2017-06-25 09:02

  本文关键词：重构大鼠脊髓星形胶质细胞骨架对AQP4和Kir4.1基因表达影响的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：探讨大鼠脊髓星形胶质细胞体外分离、纯化及培养条件,并对其进行鉴定；探讨不同浓度微丝聚合齐Jasplakinolide (JSK)和不同浓度的微丝解聚剂细胞松弛素D(Cytochalasin D, Cyt D)对大鼠脊髓星形胶质细胞的细胞骨架的影响；探讨JSK及Cyt D对大鼠脊髓星形胶质细胞AQP4和Kir4.1基因表达的影响。 方法：取新生SD大鼠10只,在无菌条件下分离出脊髓组织,体外培养原代大鼠脊髓星形胶质细胞,并采用免疫荧光法检测GFAP蛋白的表达对星形胶质细胞进行鉴定；将星形胶质细胞分为JSK实验组和Cyt D实验组并设立空白对照组。JSK实验组采用浓度为0.05μg/ml、0.10μg/ml、0.20μg/ml、0.40μg/ml、0.80μg/ml和1.00μg/ml的JSK分别干预细胞2h、12h和24h；对于Cyt D组采用浓度为0.05μg/ml、0.10μg/ml、0.20μg/ml、0.40μg/ml、0.80μg/ml和1.00μg/ml的Cyt D分别干预细胞2h、12h和24h,MTT法检测不同浓度的JSK及Cyt D对大鼠星形胶质细胞的增殖的影响；采用鬼笔环肽和Hoechst33342染色,激光共聚焦显微镜观察不同浓度的JSK及Cyt D对星形胶质细胞细胞骨架的影响；Real-time PCR法检测不同浓度的JSK及Cyt D对星形胶质细胞中AQP4和Kir4.1mRNA的表达水平的影响。 结果：大鼠星形胶质细胞体外培养14天后,细胞铺满培养皿,GFAP蛋白表达阳性率为90,符合进一步实验要求；MTT检测结果显示,与空白对照组相比,应用浓度为JSK0.05μg/ml、0.10μg/ml、0.20μg/ml和0.40μg/ml干预细胞2h后,细胞的抑制率无明显差异(P0.05),干预细胞12h和24h后具有统计学意义(P0.05); Cyt D组MTT结果显示,0.05μg/ml、0.10μg/ml、0.20μg/ml和0.40μg/ml浓度的Cyt D干预2h后,细胞的抑制率无明显差异(P0.05),干预细胞12h和24h后具有统计学意义(P0.05)；激光共聚焦显微镜观察结果显示,各浓度的JSK作用于星形胶质细胞2h后,均能使细胞微丝发生团聚,各Cyt D作用大鼠脊髓星形胶质细胞2h后,微丝发生解聚、弯曲,但极性未失；Real-time PCR检测显示,在0.05μg/ml、0.10μg/ml、0.20μg/ml、0.40μg/ml浓度的JSK作用2h后,可以显著降低细胞中AQP4和Kir4.1基因的表达,与空白对照组相比有统计学意义(P0.05);而0.05μg/ml、0.10μg/ml、0.20μg/ml和0.40μg/ml浓度的Cyt D能够上调AQP1、AQP4和Kit4.1基因的表达与空白对照组相比有统计学意义(P0.05)。 结论：大鼠脊髓星形胶质细胞可以进行体外培养；JSK和Cyt D可使大鼠脊髓星形胶质细胞微丝发生重构；JSK和Cyt D分别可以下调AQP4和Kir4.1基因的表达及上调AQP4和Kir4.1基因的表达。
【关键词】：星形胶质细胞 细胞骨架 水通道蛋白
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 前言9-12
• 第二章 文献回顾12-13
• 第三章 细胞松弛素D重构大鼠脊髓星形胶质细胞骨架对AQP1、AQP4和Kir4.1基因表达的影响13-25
• 3.1 材料与方法13-18
• 3.1.1 实验动物13
• 3.1.2 主要仪器与试剂13-15
• 3.1.3 主要溶液的配制15
• 3.1.4 星形胶质细胞的培养15-16
• 3.1.5 星形胶质细胞的传代培养16
• 3.1.6 星形胶质细胞的鉴定16
• 3.1.7 MTT检测16-17
• 3.1.8 激光共聚焦显微观察17
• 3.1.9 实时荧光定量法检测基因的表达17-18
• 3.1.9.1 细胞总RNA提取17
• 3.1.9.2 RNA反转录为cDNA17-18
• 3.1.9.3 Real-time PCR18
• 3.1.9.4 统计学分析18
• 3.2 结果18-22
• 3.2.1 原代大鼠星形胶质细胞的培养及鉴定18-19
• 3.2.2 Cyt D对细胞增殖的影响19
• 3.2.3 Cyt D对细胞骨架的影响19-22
• 3.2.4 Cyt D对AQP1,AQP4及Kir 4.1基因的表达的影响22
• 3.3 讨论22-25
• 第四章 Jasplakinolide重构大鼠脊髓星形胶质细胞骨架对AQP4和Kir4.1基因表达的影响25-37
• 4.1 材料和方法25-30
• 4.1.1 实验动物25
• 4.1.2 主要实验仪器与实验试剂25-26
• 4.1.2.1 主要实验仪器25-26
• 4.1.2.2 主要实验试剂26
• 4.1.3 主要溶液的配制26-27
• 4.1.4 星形胶质细胞的培养27
• 4.1.5 星形胶质细胞的传代培养27
• 4.1.6 星形胶质细胞的鉴定27-28
• 4.1.7 MTT检测28
• 4.1.8 激光共聚焦显微观察28
• 4.1.9 实时荧光定量法检测基因的表达28-30
• 4.1.9.1 细胞总RNA提取28-29
• 4.1.9.2 RNA反转录为cDNA29
• 4.1.9.3 Real-time PCR29
• 4.1.9.4 统计学分析29-30
• 4.2 结果30-34
• 4.2.1 大鼠星形胶质细胞的培养与鉴定30
• 4.2.2 JSK对星形胶质细胞增殖的影响30
• 4.2.3 JSK对星形胶质细胞骨架的影响30-33
• 4.2.4 JSK对AQP4及Kir4.1基因的表达的影响33-34
• 4.3 讨论34-37
• 第五章 参考文献37-39
• 第六章 小结39-40
• 在学校期间的研究成果40-41
• 缩略词表41-42
• 致谢42

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 王克万,漆松涛,杨志焕,王正国,朱佩芳,杨开军,刘承勇,黄理金;培养大鼠星形胶质细胞牵张损伤后超微结构的变化[J];第一军医大学学报;2002年08期

2 ;Aquaporins as potential drug targets[J];Acta Pharmacologica Sinica;2006年04期

3 王彦明;余家阔;于长隆;敖英芳;王健全;崔国庆;胡跃林;;Pridie钻孔术修复膝关节软骨全层缺损的临床疗效观察[J];中国微创外科杂志;2006年11期

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本文编号：481479